Struktur - Funktions - Beziehungen der Dipeptidylpeptidase IV/CD26

Abstract

Die Dipeptidylpeptidase IV (DPPIV, EC 3.4.14.5) wurde erstmals 1966 als Exopeptidase beschrieben und 1990 als T Zell-Aktivierungsmarker CD26 identifiziert. Seitdem wurden folgende Eigenschaften von DPPIV/CD26 aufgezeigt: Aktivierung und Inaktivierung biologisch aktiver Peptide, Beteiligung an der Zell-Zell- und der Zell-Matrix-Adhäsion, Endopeptidase- Aktivität und Ko-Stimulation bei der T-Zell-Aktivierung. Ferner wurde nachgewiesen, daß sie ein Rezeptor der Adenosindesaminase (ADA) ist. Diese Arbeit soll einen Beitrag zur Klärung der Struktur und Funktionen sowie der molekularen Grundlagen dieses multifunktionellen Proteins leisten. Zu Beginn dieser Arbeit wurde die bislang nicht vollständig geklärte Primärstruktur der DPPIV/CD26 durch cDNA-Klonierung und Sequenzierung ermittelt. Durch gezielte Mutagenese wurde das katalytische Zentrum charakterisiert. Es ist im C-Terminus der extrazellulären Domäne des Proteins lokalisiert und wird durch die drei Aminosäuren Ser631, Asp709 und His741, die sogenannte katalytische Triade, gebildet. Wir haben nachgewiesen, daß DPPIV/CD26 nach ihrer Expression auf der Zelloberfläche eine weitere Translokation (Recycling) in Endosomen durchführt, wobei die N-Glykanseitenketten der DPPIV/CD26 weiter modifiziert (Reprocessing) werden. An diesem Modell-Glykoprotein konnte nachgewiesen werden, daß die N-Glykosylierung eine wichtige Rolle für die Proteinfaltung spielt. Außerdem wurde die Funktion der 12 Cysteinreste der DPPIV/CD26 bei der Ausbildung der funktionellen Konformation aufgeklärt. Da DPPIV/CD26 ein multifunktionelles Protein ist, stehen Untersuchungen zur Beteiligung von DPPIV/CD26 an komplexen zellulären Mechanismen im Mittelpunkt. Untersucht wurden T-Zell-Aktivierung, Zelladhäsion und mit diesen gekoppelte Funktionen. Die Enzymaktivität von DPPIV/CD26 ist offenbar weder für ihre Adhäsion auf Kollagen I noch für ihre kostimulatorische Wirkung auf die T-Zell-Aktivierung notwendig. Bei der DPPIV/CD26-vermittelten T-Zell-Aktivierung ist die Adenosindesaminase (ADA) nicht an der Stimulation der IL-2-Sekretion beteiligt, jedoch werden die DPPIV/CD26-vermittelten zellulären Signale durch die Wechselwirkung von Kollagen Typ I und DPPIV/CD26 stark beeinflußt. Aus den erhobenen Befunden ergab sich die Frage, wie DPPIV/CD26 als ein multifunktionelles Protein in vivo wirkt und welche Rolle dieses Protein bei Krankheiten spielt. Hierzu wurde die Rolle der DPPIV/CD26 bei der Immunantwort sowie bei verschiedenen Krankheiten, wie z. B. Infektionskrankheiten (Tuberkulose), allergischen Krankheiten (Asthma) und Autoimmunerkrankungen (EAE: Experimentelle Autoimmune Encephalomyelitis), am Modell von DPPIV/CD26 -Knock-out-Mäusen untersucht. Obwohl die DPPIV/CD26-Knock-out-Mäuse keinen auffälligen Phänotyp zeigten, beeinflußt die Ausschaltung des DPPIV/CD26-Gens die Entwicklung, Reifung und Migration von CD4+-, NK- und CD4+-NKT-Zellen. Nach Stimulation der Mäuse mit PWM (pokeweed mitogen) wurde die Wirkung von DPPIV/CD26 auf die Cytokin-Sekretion und die T-Zell-abhängige Antikörperproduktion deutlich. Am ausgeprägtesten waren die verminderte Sekretion von IL-4 und IgG in DPPIV/CD26-Knock-out-Mäusen. Nach Immunisierung und anschließender Aerosolaufnahme des Ovalbumins wurde eine ausgeprägte Eosinophilie und gesteigerte Entzündung in den Atemwegen der DPPIV/CD26-Knock- out-Mäuse beobachtet. Schließlich konnte durch die Aufklärung der Raum- und Kristallstrukturen der Ratten-DPPIV/CD26 und des Komplexes aus humaner DPPIV/CD26 und der Rinder-ADA eine Basis für die Beschreibung von Struktur- Funktionsbeziehungen des multifunktionellen Proteins geschaffen werden. Besonders hervorzuheben ist der Nachweis einer zweiten seitlichen Öffnung in der DPPIV/CD26, die mit der ersten Öffnung im Bereich der ß-Propellerdomäne durch einen das Monomer durchziehenden Kanal verbunden ist. Bei dem hDPPIV/CD26-bADA-Komplex bindet sich die bADA an den äußeren Kanten zwischen Blatt IV und V der -Propellerdomäne der hDPPIV/CD26, während hDPPIV/CD26 an die -Helix des bADA-Moleküls bindet. Ein direkter Kontakt zwischen 14 Aminosäuren aus hDPPIV/CD26 und 13 Aminosäuren aus bADA ermöglicht die Bindung beider Proteine. Die Aufklärung der 3D-Struktur und Kristallstruktur der DPPIV/CD26 und des DPPIV/CD26-ADA-Komplexes verhilft uns zu einem besseren Verständnis, des katalytischen Mechanismus, der Wechselwirkung von DPPIV/CD26 mit ADA und anderen Proteinen sowie der funktionellen Mechanismen dieses multifunktionellen Membranglykoproteins.

Dipeptidyl peptidase IV (DPPIV, EC 3.4.14.5) was described as an exopeptidase for the first time in 1966 and later, in 1990, identified as the T cell activation marker CD26. Since then several biological functions for this protein have been determined, such as endopeptidase activity, activation and inactivation of biological active peptides, co-stimulation of T cell activation, involvement in cell-cell- and cell-matrix-adhesion processes, as well as a receptor for the adenosine deaminase (ADA). This work was intended to contribute to the clarification of the structure and functions as well as the molecular characteristics of this multifunctional protein. At the beginning of the work the primary structure of DPPIV/CD26, which had not been completely elucidated before, was determined by cDNA-screening, cloning and sequencing. The catalytic site of this enzyme was characterized by using site- directed mutagenesis. The reaction center is located at the C-terminus of the extracellular domain of this protein, in the so-called catalytic triad consisting of the three amino acids: Ser631, Asp709 and His741. We found that DPPIV/CD26 undergoes translocation to the endosomes after being expressed on the plasma membrane (recycling) and, thereafter, its N-glycan structures are further modified (reprocessing). In our model we have determined that the cotranslational N-glycosylation of DPPIV/CD26 is important for the attainment of a correctly folded, stable conformation of this glycoprotein. Furthermore, we have shown that 12 cysteines, which form disulfide bridges, play an essential role in the building and maintenance of the tertiary structure and biological properties of this protein. Because of its multifunctional character, we focused on the question to what extent such functions are coupled with each other. We found that the enzymatic activity of DPPIV/CD26 is neither apparently necessary for the adhesion of DPPIV/CD26 to the collagen I nor for its co-stimulatory activity of the T cell activation. Although adenosine deaminase is not involved in the DPPIV/CD26-mediated T cell activation, the interaction of DPPIV/CD26 with collagen I significantly inhibits DPPIV/CD26 mediated cellular signal transduction. From the results obtained we asked how DPPIV/CD26 functions as a multifunctional protein in vivo and which role it plays in diseases. Thereby, the role of DPPIV/CD26 in the immune response, as well as in different diseases, such as infection disease (tuberculosis), allergical diseases (asthma) and autoimmune diseases (EAE: experimental autoimmune encephalomyelitis), was investigated using DPPIV/CD26-knockout-mice. Although the DPPIV/CD26-knockout-mice display an apparently normal phenotype, the elimination of the DPPIV/CD26 gene showed an influence on the development, maturation and migration of CD4+-, NK- and CD4 +-NKT-cells. After stimulation of mice with pockeweed mitogen (PWM), an effect of DPPIV/CD26 on the cytokine secretion and T cell-dependent antibody production was observed. DPPIV/CD26-/- mice showed a markedly reduced secretion of IL-4 and IgG-production. After ovalbumin sensitization and challenge, DPPIV/CD26-/- mice exhibited an exaggerated bronchial infiltration of leukocytes, especially eosinophils, and increased airway inflammation. Finally, in order to analyze the structure-functions relationships of this multifunctional protein at the molecular level, we aimed to elucidate the three-dimensional structure of DPPIV/CD26. For that purpose the 3D-structures which were reconstructed by cryo-EM and single particle analysis, and the crystal structures of rat DPPIV/CD26 and the human DPPIV/CD26 in complex with bovine adenosine deaminase (ADA) were obtained. The most prominent result is the demonstration of a second side opening in DPPIV/CD26 which connects with the first opening at the outer top face through a channel and would enable direct access to the catalytic site. The 3D- and crystal structure of the CD26-ADA complex showed that the ADA-binding site is stretched across CD26 ß-propeller blades IV and V, while DPPIV/CD26 interacts with the -helices of ADA. 14 amino acids of hDPPIV/CD26 and 13 amino acids of bADA are directly involved in this interaction. The clarification of the 3D- and crystal structure of DPPIV/CD26 and DPPIV/CD26-ADA-complex allows us to better understand the catalytic mechanism, the interaction of DPPIV/CD26 with ADA and other proteins, as well as functional molecular basis of the multifunctional membrane glycoprotein.