Synthesis of Parasite Related Carbohydrates and their Use as Probes for Glycobiology

Abstract

Carbohydrates are a class of structurally diverse biomolecules that surround every cell of all living organisms. Glycans found on mammalian cells differ significantly from saccharides presented on the surface of pathogenic organisms. Therefore the immune system of higher animals can differentiate self from non-self by interacting with sugars displayed on plasma membranes and consequently raise an immune response against foreign carbohydrate structures to eliminate pathogens. Investigating the immunogenicity of a sugar or its interaction with a carbohydrate binding protein to assess structure- activity relationships is difficult, because an amplification method for glycans does not exist and isolation of reasonable quantities of single molecular species remains challenging. Chemical synthesis of oligosaccharides has emerged as a strategy to overcome the aforementioned obstacles. The goal of this thesis was the generation of a library of pathogen related carbohydrates and their employment in different in vitro and in vivo essays to analyze their interaction with the immune system or single components thereof. In the first part of this thesis (Chapter 2) a general and convergent method, which features a set of fully orthogonal protecting groups allowing the introduction of late stage modifications, was used to prepare derivatives of glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchors and their corresponding substructures. The synthesized compounds resemble the phosphoglycan moiety of GPIs presented on the plasma membrane of the apicomplexan parasite Toxoplasma gondii. All synthetic carbohydrates were equipped with either a thiol or amine linker that enables fabrication of neoglycoconjugates and carbohydrate microarrays. In the second part of this thesis (Chapter 3) two T. gondii- specific GPI glycans were coupled to the carrier protein CRM197 to form two neoglycoconjugates, which were evaluated for their immunogenic properties in an animal model. The IgG immune response elicited by the glycoconjugates in mice was highly specific towards the full phosphoglycans exhibiting no cross- reactivity towards a structurally closely related mammalian GPI or corresponding substructures. Furthermore, it was shown that the polyclonal mouse serum recognized T. gondii tachyzoites revealing distinct differences in the surface localization of the two glycolipids. Carbohydrate microarray analysis of sera from humans suffering from toxoplasmosis confirmed that GPIs of T. gondii are immunogenic and capable of inducing an early IgM response in infected individuals (in collaboration with Prof. Dr. Uwe Groß, Universitätsklinikum Göttingen). Taken together these results form the basis for the development of a GPI-based vaccine against this obligate parasite and a diagnostic tool for the detection of toxoplasmosis in humans. However, further tests and challenge studies will be required to evaluate the protective properties of this potential carbohydrate conjugate vaccine. In the last part of this thesis (Chapter 4) the binding preferences of the human lectin ZG16p, which may be involved in innate immunity, were defined by using glycan microarray and NMR studies (in collaboration with Prof. Ten Feizi, Glycosciences Laboratory, Imperial College, London and Dr. Yoshiki Yamaguchi, Structural Glycobiology Team, RIKEN, Tokyo). A glycan microarray analysis identified phosphatidylinositol mannosides (PIMs), which are major cell wall components of some pathogenic bacteria including Mycobacterium tuberculosis, as novel ZG16p ligands. On this account analogs of these glycolipids were synthesized and employed in STD-NMR experiments to define binding epitopes. These findings raise the possibility that human lectin ZG16p is involved in the mucosal immune response by ‘opsonizing’ mycobacteria via an interaction with PIMs on the cell surface of the pathogen. This hypothesis is subject for future investigations.

Kohlenhydrate gehören zu einer Klasse strukturell diverser Biomoleküle, die jede Zelle aller lebenden Organismen umgeben. Glykane die auf Säugetierzellen vorhanden sind unterscheiden sich signifikant von Sacchariden die auf der Oberfläche von pathogenen Erregern vorkommen. Auf Grund dieser Differenz kann das Immunsystem höherer Tiere durch Interaktionen mit Zuckern, die auf der Plasmamembran präsentiert sind, Fremdorganismen von eigenen Körperzellen unterscheiden und eine Immunantwort, die Pathogene eliminiert, gegen körperfremde Kohlenhydrate erzeugen. Die Untersuchung der Immunogenizität von Zuckern oder ihre Wechselwirkung mit Kohlenhydrat-bindenden Proteinen, um Struktur-Wirkungsbeziehungen zu erstellen, ist schwierig, da keine Vervielfältigungsmethode für Glykane existiert und die Isolierung angemessener Mengen reiner Saccharide anspruchsvoll ist. Die chemische Synthese von Oligosacchariden wurde deshalb als Strategie gewählt um die obengenannten Hürden zu umgehen. Das Ziel dieser Doktorarbeit war die Generierung einer pathogen-assoziierten Kohlenhydratbibliothek und deren Verwendung in verschiedenen in vitro und in vivo Experimenten, um ihre Wechselbeziehung mit dem Immunsystem oder einzelnen Komponenten davon zu untersuchen. Im ersten Teil dieser Dissertation (Kapitel 2) wurde eine generelle und konvergente synthetische Methode, welche als Besonderheit einen Satz an vollkommen orthogonalen Schutzgruppen aufweist und eine Einführung von verschiedenen Modifizierungen im späten Stadium der Synthese ermöglicht, genutzt, um Derivate von Glycosylphosphatidylinositiol (GPI)-Ankern und deren entsprechenden Substrukturen darzustellen. Die synthetischen Kohlenhydrate spiegeln die Phosphoglykanstruktur von GPIs wieder, welche auf der Plasmamembran des Parasiten Toxoplasma gondii, der zu den Apicomplexa gehört, vorliegen. Alle Verbindungen wurden entweder mit einem Thiol- oder Amino- Linker versehen, der die Anfertigung von Glykanmicroarrays oder Neoglycoproteinen erlaubt. Im zweiten Teil dieser Dissertation (Kapitel 3) wurden zwei T. gondii spezifische GPI-Glykane kovalent mit dem Carrier Protein CRM197 verknüpft, um zwei Neoglycoproteine herzustellen, deren Immunogenizität in einem Tiermodel evaluiert wurde. Die IgG Immunreaktion, welche durch die Glykoconjugate ausgelöst wurde, war hochspezifisch und gegen die komplette Phosphoglycanstruktur gerichtet. Kreuzreaktionen gegen unterschiedliche Substrukturen oder einen strukturell eng verwandten GPI-Anker, der in Säugetierzellen vorkommt, konnten nicht festgestellt werden. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass das erhaltene polyklonale Mausserum T. gondii Tachyzoiten erkennt und es deutliche Unterschiede in der Lokalisierung der GPIs auf der Oberfläche des Parasiten gibt. Eine Glykanmicroarrayanalyse von Blutseren, welche von Menschen stammen, die an einer Toxoplasmose leiden, bestätigte, dass GPIs von T. gondii immunogen sind und eine frühe IgM Immunreaktionen in Menschen hervorrufen (in Zusammenarbeit mit with Prof. Dr. Uwe Groß, Universitätsklinikum Göttingen). Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Resultate die Basis für die Entwicklung eines GPI-basierten T. gondii Impfstoffes und diagnostischen Tests, der eine Toxoplasmose in Menschen nachweisen kann, darstellen. Allerdings müssen noch weitere Untersuchungen und Challenge Studien durchgeführt werden um die protektiven Eigenschaften dieser potentiellen Kohlenhydratimpfstoffe bewerten zu können. Im letzten Teil dieser Dissertation (Kapitel 4) wurde die Bindungspräferenz des humanen Lectins ZG16p, welches möglicherweise einen Teil der angeborenen Immunantwort darstellt, mit Hilfe von Glykanmicroarrays und NMR-Experimenten bestimmt (in Zusammenarbeit mit Prof. Ten Feizi, Glycosciences Laboratory, Imperial College, London und Dr. Yoshiki Yamaguchi, Structural Glycobiology Team, RIKEN, Tokyo). Eine Glykanmicroarrayanalyse konnte Phosphatidylinositol Mannoside (PIMs), die einen Hauptbestandteil der Zellwand von verschiedenen pathogenen Bakterien wie beispielsweise Mycobacterium tuberculosis ausmachen, als neue Liganden von ZG16p identifizieren. Aus diesem Grund wurden Analoga dieser Glycolipide synthetisiert und in STD-NMR Experimenten verwendet, um deren Bindungsepitope zu bestimmen. Die erhaltenen Ergebnisse unterstützen die Hypothese, dass dieses Lectin eine Rolle während der Immunabwehr in der Darmschleimhaut spielt, in dem es Mykobakterien durch die Interaktion mit den PIMs auf deren Oberfläche “ opsonisiert“. Diese Theorie ist Gegenstand zukünftiger Forschung.