Identifizierung von differentiellen Proteinen aus dem E. coli basierten in vitro Translationssystem

Abstract

Mit Hilfe der hochauflösenden zweidimensionalen Gelelektrophorese und anschließenden MALDI-Analyse wurden 21 Proteine identifiziert, die sich während der Proteinsynthese im in vitro Translationssystem verändert haben. Zuvor mussten einige methodische Probleme gelöst werden, die die Probenvorbereitung zur 2-DE betrafen. Die niedermolekularen Bestandteile mussten aus dem Standardreaktionsansatz entfernt und die Proteine angereichert werden. Es zeigte sich, dass die wichtigen, differentiellen Proteine nur durch schwache Spots nach der Färbung der Gele vertreten waren. Die Proben wurden daher mit Hilfe der Umkehrphasen-HPLC entsalzt, fraktioniert und aufkonzentriert. Unter den differentiellen Proteinen befanden sich regulatorische Proteine, substratbindende Proteine, Proteinreparaturenzyme, RNA-bindende Proteine bisher nicht genau definierter Funktion und direkt in die Translation involvierte Proteine. Sie geben Hinweise auf den Gesamtzustand, Regulationsmechanismen und unerwünschte Nebenreaktionen im Lysat. Beispielsweise konnte ausgehend von dem als differentiell erkannten Putrescin/Spermidin- periplasmatischen Transportprotein der Status und Einfluss dieser beiden Polyamine auf die Proteinsynthese geklärt werden. Aus dem Gesamtstatus der Polyamine konnte eine weitere wichtige Information entnommen werden: Agmatin, ein Abbauprodukt von Arginin und Ausgangsstoff für die Synthese von Putrescin und Spermidin erreichte während der Protein- synthese einen schnellen Konzentrationsanstieg. Kurz vor Abbruch der Proteinsynthese wird ein Konzentrationsmaximum erreicht und die Agmatinsynthese eingestellt. Der schnelle Konzentrationsabfall der Aminosäure Arginin findet damit eine Erklärung. Die zeitliche Abfolge des Agmatinoptimums, des gleichzeitigen Erreichens eines Plateaus der Protein- und mRNA-Konzentration, sowie der anschließenden Hydrolyse von ATP und GTP lassen einen regulierten Prozess vermuten. Das differentielle Protein HtrA, als Chaperon und Protease wirkend und in Eukaryonten als Gegenspieler des Apoptoseinhibitors bekannt, unterstreicht die These, dass der Abbruch der Proteinsynthese ein wichtiges Teilereignis in einem Regulationsnetzwerk sein könnte.

High resolution two-dimensional gel electrophoresis (2-DE) and subsequent analysis of differential proteins by peptide fingerprint is an important tool to identify changes in complex protein mixtures. We used 2-DE to investigate the early abrogation of protein biosynthesis in an E.coli based in vitro translation system. We identified twenty one differential proteins by comparing protein patterns between start and end of the translation. In order to obtain those results various methodical problems concerning the sample preparation had to be resolved. This involved removal of low molecular weight components and amplification of the weak spots typical for most differential proteins in our system. Therefore all samples were desalted, fractionated and concentrated by reversed phase HPLC. Among the differential proteins regulatory proteins, substrate binding proteins, protein repair enzymes, RNA binding proteins of unknown function and proteins directly involved in translation were detected. From such observations, conclusions can be drawn about the general state, regulatory mechanisms and undesired side reactions in the E.coli lysate. For example starting from the identification of the putrescine/spermidine periplasmatic transport protein as a differential protein the state and influence of these two polyamines on the protein biosynthesis could be determined. Moreover we could obtain an important information through analysis of the general state of the polyamines. Concentration of agmati ne, a degradation product of the amino acid arginine and a substrate for the synthesis of putrescine and spermidine, increased and reached a peak shortly before the translation stopped. We found that the protein synthesis remained constant shortly after the maximum of the agmatine concentration was reached. Further an observation by Kim and Swartz (2000), who described a massive decrease of the concentration of arginine during in vitro translation, can be explained now. The time course of the reactions in our system implies, that those reactions are part of a regulatory network. Interesting in this respect is the differential protein HtrA, which can act as a protease or a chaperone, and which is a part of the apoptosis machinery in eukaryotic cells.