Functional characterization of the potential immune evasion proteins pUL49.5 and p012 of Marek’s disease virus (MDV)

Abstract

In the process of co-evolution with their hosts, herpesviruses have developed advanced mechanisms to counteract and evade the innate and adaptive responses of their hosts. Herpesviruses boast an impressive number of immunomodulatory proteins, commonly referred to as immune evasins, and their functions range from decoy receptors and virokines to modulators of the cytotoxic T cell response. Marek’s disease virus (MDV), an alphaherpesvirus, is the causative agent of a lethal disease in chickens characterized by generalized nerve inflammation and rapid lymphoma development. During lytic replication, MDV induces a drastic reduction of major histocompatibility complex (MHC) class I expression on the surface of infected cells, which allows the virus to shield itself from destruction by the cytotoxic T cell response. Currently, it remains unclear a) which proteins are responsible for MDV MHC class I downregulation and b) to what extent this and other immune evasion strategies influence the severity of disease, in particular tumorigenesis. The MDV homologue of the conserved herpesviral UL49.5 gene encodes a small endoplasmic reticulum (ER) transmembrane protein which has been postulated as a likely MHC class I modulator due to its supposed interference with the transporter associated with antigen processing (TAP), a function which has been demonstrated for members of the genus Varicellovirus. Through the generation of a mouse anti-UL49.5 antibody as well as a replication-competent UL49.5 knock-out virus in the course of my thesis project, novel tools for investigation of the pUL49.5 function are now available. However, the presented results within this thesis indicate that MDV pUL49.5 is not responsible for downregulation of MHC class I molecules on the surface of infected primary chicken embryo cells. Investigations with ectopically expressed UL49.5 confirmed those findings and additionally indicated that pUL49.5 does not lead to proteasome-mediated TAP degradation, a function which has been proposed in the past as its likely mode of action. Further investigations of pUL49.5 were obstructed by severe protein stability issues of unknown origin, which could not be solved by inhibiting cellular pathways of protein degradation. These enigmatic observations together with an obvious context- dependence of the protein’s expression (e.g., cell type), make some of my results, as well as previous studies, regarding the function of MDV pUL49.5 difficult to interpret. In a second part of my project, the previously unidentified MDV ORF012 gene was characterized in detail and first evidence for its involvement in immune evasion was obtained. The extensive colinearity of the MDV genome with related herpesviruses has eased functional characterization of many MDV genes. However, MDV contains a number of unique open reading frames (ORFs) that have not yet been characterized regarding their full coding potential and the functions of their products. Among these unique ORFs are two putative ORFs, ORF011* and ORF012*, which are found at the extreme left end of the MDV unique-long region. Using reverse transcription PCR I showed that ORF011* and ORF012* are not individual genes, but encode a single gene through mRNA splicing of a small intron, giving rise to what I dubbed ORF012. An ORF012-null virus was generated using an infectious clone of MDV strain RB-1B. The deletion virus had a marked growth defect in vitro and could not be passaged in cultured cells suggesting an essential role for the gene product during virus replication. Further studies revealed that protein (p)012 localized to the nucleus in transfected and infected cells and I identified by site-directed mutagenesis and GFP reporter fusion assays a nuclear localization signal (NLS) that was mapped to a 23 amino acid sequence at the protein’s C-terminus. Nuclear export was blocked using leptomycin B suggesting a potential role for p012 as a nuclear/cytoplasmic shuttling protein. Furthermore, p012 is phosphorylated at multiple residues, a modification that could possibly regulate the subcellular distribution of the protein. A preliminary microarray experiment also indicated that p012 decreases transcripts of chicken interleukin 17B, a proinflammatory cytokine, suggesting that the protein could be potential modulator of the host immune system.

Im Zuge der Koevolution mit ihrem Wirt haben sich bei Herpesviren elegante Strategien zur Umgehung des angeborenen und des adaptiven Immunsystems entwickelt. Sie besitzen eine beeindruckende Anzahl von immunmodulatorischen Proteinen, sogenannten Immunevasine, die von viruskodierten Rezeptoren über virale Chemokine (Virokine) bis hin zu Modulatoren der zytotoxischen T-Zellantwort reichen. Das Virus der Marekschen Krankheit (MDV) gehört zur Subfamilie der Alphaherpesviren und löst in Hühnern eine tödliche Erkrankung, die durch eine generalisierte Nervenentzündung und der Entstehung von Lymphomen geprägt ist, aus. Während der lytischen Infektion von Hühnerzellen mit dem MDV, kommt es zur einer drastischen Reduktion der Expression des sogenannten Haupthistokompatibilitätskomplexes der Klasse I (MHC-I) auf der Zelloberfläche. Dadurch kann das MDV der Zerstörung durch die zytotoxische T-Zellantwort des adaptiven Immunsystems entgehen. Momentan ist allerdings unklar, welche Proteine des MDV hierfür verantwortlich sind und in welchem Ausmaß diese und andere Immunevasionsstrategien die Schwere der Erkrankung, im Speziellen die Tumorentstehung, beeinflussen. Das dem Herpes simplex virus UL49.5 homologe Gen in MDV, welches auch in anderen Herpesviren konserviert ist, kodiert für ein kleines Typ 1-Membranprotein mit Lokalisation im endoplasmatischen Retikulum (ER). Basierend auf früheren Studien mit Viren aus dem Genus Varicellovirus wurde postuliert, dass auch das MDV UL49.5-Protein (pUL49.5) die Reduktion von MHC Klasse I-Molekülen über die Blockade des Antigenpeptid-Transporters (TAP) steuern könnte. Diese Hypothese wurde in der vorliegenden Arbeit getestet. Mit der Herstellung eines spezifischen pUL49.5-Antiserums in Mäusen sowie eines replikationsfähigen UL49.5-Deletionsviruses stehen nun zwei neue Werkzeuge zur Untersuchung des Proteins zur Verfügung. Die hier beschriebenen Ergebnisse implizieren, dass pUL49.5 nicht für die Reduktion von MHC Klasse I-Molekülen auf der Oberfläche von infizierten Hühnerembryozellen verantwortlich ist. Weitere Untersuchungen mit pUL49.5, welches nach Transfektion von entsprechenden Expressionsplasmiden gebildet wurde, bestätigten diese Ergebnisse und zeigten des Weiteren, dass pUL49.5 nicht zum Abbau von TAP durch das Proteasom führt. Dieser Abbau von TAP wurde bis dato als mögliche Funktionsweise des Proteins vorgeschlagen. Weitere Untersuchungen zum pUL49.5 wurden leider durch ungeklärte Probleme mit der Stabilität des Proteins, welche nicht durch die Inhibition von zellulären Abbaumechanismen gelöst werden konnten, gehemmt. Die Expression des Proteins schien durch weitere Faktoren, zum Beispiel den verwendeten Zelltypen, beeinflusst zu sein. Zusammenfassend erschweren die aufgeführten Beobachtungen die Interpretation einiger der hier dargestellten Ergebnisse sowie derer früherer Veröffentlichungen deutlich. In einem zweiten Projekt der Promotionsarbeit wurde das bislang unbekannte MDV-Gen ORF012 im Detail charakterisiert und erste Hinweise auf eine mögliche Funktion als immunmodulatorisches Gen erhalten. Die Koliniarität des MDV- Genoms mit dem verwandter Herpesviren hat in der Vergangenheit die Charakterisierung vieler MDV Gene vereinfacht. Dennoch enthält das MDV einige einzigartige Gene, die bisher noch nicht bezüglich ihrer Funktion untersucht worden. Unter diesen unbekannten offenen Leserastern (ORFs) befinden sich zwei vorhergesagte ORFs, die als ORF011* und ORF012* bezeichnet werden und sich am äußersten linken Ende der Unique-Long-Region des MDV-Genoms befinden. Im Zuge dieses Projektes wurde mit Hilfe von reverser Transkriptions-PCR gezeigt, dass es sich bei den Genen ORF011* und ORF012* eigentlich um ein einzelnes Gen (nun als ORF012 bezeichnet) handelt, welches durch das Spleißen eines kleinen Introns zur Herstellung einer einzelnen Boten-RNA (mRNA) führt. Basierend auf dem MDV- Stamm RB-1B wurde eine ORF012 Deletionsmutante hergestellt. Diese Virusmutante zeigte schwere Replikationsdefekte in vitro und die Infektion konnte nicht durch Passagierung infizierter Zellen ausgeweitet werden. Eine entscheidende Rolle des Proteins im Replikationszyklus des Virus ist daher wahrscheinlich. In weiteren Studien konnte die Lokalisierung des Proteins 012 (p012) im Zellkern von infizierten und transfizierten Zellen nachgewiesen werden. Mit Hilfe von spezifischer Mutagenese und GFP-basierten Reporterkonstrukten konnte im C-terminalen Ende des Proteins ein nukleäres Lokalisierungssignal identifiziert werden. Auch konnte der nukleäre Export des p012 durch den Inhibitor Leptomycin B unterbunden werden. Hieraus läßt sich schließen, dass es sich um ein, zwischen dem Zellkern und dem Zytoplasma pendelndes, Protein handeln könnte. Die starke Phosphorylierung von p012, welche die Verteilung des Proteins innerhalb der Zelle regulieren könnte, wurde ebenso nachgewiesen. Zum vorläufigen Abschluss des Projektes wurde ein Microarray-Experiment durchgeführt. Hierbei ergaben sich erste Hinweise, dass das Protein 012 die Menge der spezifischen mRNA des entzündungsfördernden Zytokins Interleukin 17B reduzierte. Dieses Ergebnis spricht für die Möglichkeit, dass es sich bei p012 um ein immunomodulatorisches Protein handelt.