Hemmung der Tumormetastasierung durch Verhinderung der Interaktion zwischen zirkulierenden Tumorzellen und Thrombozyten mittels dualer Liposomen im Mausmodell

Abstract

Tumormetastasierung ist ein komplexer Prozess, bei dem sich maligne Tumorzellen vom Primärtumor ablösen, in das Blutgefäßsystem einwandern und dort vor allem mit Thrombozyten oder dem Gefäßendothel interagieren, bevor sie in das umliegende Gewebe eindringen und dort Metastasen bilden. Mehrere Studien haben gezeigt, dass zirkulierende Tumorzellen in der Lage sind, Thrombozyten zu aktivieren, was zur Ausbildung von Komplexen aus Thrombozyten und Tumorzellen führen kann. Diese Aggregate können in engen Blutkapillaren verstärkt an das Endothel adhärieren, wodurch die Auswanderung der Tumorzellen erleichtert und damit die Metastasenbildung gefördert wird. Das Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung eines liposomalen Systems, das gleichzeitig eine zytotoxische Substanz und einen Thrombozytenaggregationshemmer enthält, wodurch eine wirksame Hemmung der Metastasierung erreicht werden sollte. Diese Liposomen sollten die Thrombozytenaggregation und Komplexbildung mit Tumorzellen reduzieren und damit die Metastasenbildung in verschiedenen Mausmodellen einschränken oder verhindern. Duale Liposomen, die zwei unterschiedliche Wirkstoffe enthalten, wurden durch die Lipidfilm- Hydrationsmethode hergestellt. Diese Vesikel wurden hinsichtlich ihrer Stabilität, sowie ihres Wirkstoff- und Lipidgehalts charakterisiert. Die Hemmung der Thrombozytenaggregation durch duale Liposomen in vitro wurde mittels Impedanz-Aggregometer gemessen und die Verhinderung der Komplexbildung von Tumorzellen in Gegenwart von Thrombozyten durch diese Liposomen wurde mikroskopisch analysiert. Anschließend wurde nach Charakterisierung der zu verwendenden Metastasierungsmodelle der anti-metastatische Effekt der dualen Liposomen in einem experimentellen und einem spontanen Metastasierungsmodell für Brustkrebs in Mäusen quantifiziert. Es wurden Liposomen hergestellt, die das zytotoxische Alkylphospholipid OPP und einen der beiden Thrombozytenaggregationshemmer Dipyridamol (DIP/OPP-L) oder Cilostazol (Cil/OPP-L) in ihrer Membran verkapselt haben. DIP/OPP-L und Cil/OPP-L konnten die Thrombozytenaggregation in vitro um 60 % bzw. 80 % reduzieren sowie die Komplex-bildung von Tumorzellen in Gegenwart von aktivierten Thrombozyten vollständig verhindern. In vivo konnten beide dualen Liposomenformulierungen die Metastasierung im experimentellen Metastasierungsmodell mit MT3 Brustkrebszellen um bis zu 90 % und im Spontanmetastasierungsmodell mit 4T1 Brustkrebszellen um bis zu 50 % reduzieren. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Liposomen, die eine Wirk-stoffkombination aus einer zytotoxischen Substanz und einem Thrombozytenaggregations-hemmer enthalten, in der Lage sind, die Interaktion zwischen Tumorzellen und Thrombozyten zu beeinflussen und dadurch die Metastasierung in verschiedenen Mausmodellen signifikant zu reduzieren. Diese neu entwickelten Liposomenformulierungen stellen eine vielversprechende Herangehensweise zur Hemmung der Metastasierung dar.

Tumor metastasis is a complex process where malign tumor cells detach from the primary tumor and invade the blood stream. There the tumor cells interact with platelets or the endothelium before they invade the surrounding tissue to develop new metastases. Several studies showed, that circulating tumor cells are able to activate platelets which results in the development of tumor cell- platelet aggregates. These complexes can adhere easily to the endothelium in small blood vessels, which enhances tumor cell extravasation and metastasis. The aim of this PhD thesis was the development of a liposomal system that encapsulates a cytotoxic substance and a platelet aggregation inhibitor at the same time to obtain an effective inhibition of metastasis. These liposomes should reduce platelet aggregation and complex formation of tumor cells and platelets and therefore reduce metastasis in different mouse models in vivo. Dual liposomes which contain two different active drugs were prepared by lipid film-hydration method. The vesicles were characterized regarding their stability and their drug and lipid content. The inhibition of platelet aggregation by dual liposomes in vitro was characterized with an impedance aggregometer. The complex formation of tumor cells in the presence of activated platelets was quantified microscopically. After characterization of the mouse metastasis models, the anti-metastatic effect of the dual liposomes was quantified in an experimental and a spontaneous metastasis model in mice. Liposomes were prepared, that encapsulate the cytotoxic alkylphospholipid OPP and one of the platelet aggregation inhibitors Dipyridamol (DIP/OPP-L) or Cilostazol (Cil/OPP-L) in their membrane. DIP/OPP-L and Cil/OPP-L were able to reduce platelet aggregation in vitro by 60 % and 80 %, respectively and completely abolished complex formation of tumor cells in the presence of activated platelets. In vivo both dual liposomal formulations could reduce metastasis by up to 90% in the experimental MT3 metastasis model and up to 50% in the spontaneous metastasis model using 4T1 breast cancer cells. This project demonstrated, that liposomes containing a combination of a cytotoxic substance and a platelet aggregation inhibitor are able to influence the interaction between circulating tumor cells and platelets and thereby reducing metastases formation in different mouse models. Those newly developed liposomes are a promising method to reduce metastasis.