miR-128: a Pleiotropic Regulator of Neuronal Translation

Abstract

microRNAs are an evolutionarily conserved mechanism for controlling mRNA translation. The genomes of living organisms contain hundreds of microRNA genes, each with the ability to regulate specific pathways. The focus of my thesis was to study in detail one particular microRNA: miR-128. When I started my PhD the only information on miR-128 was that it is one of the most abundant microRNAs in the brain, that it is specifically expressed in the neuronal lineage and that it is dramatically upregulated during embryonic and postnatal brain development. There are two genes for miR-128, each encoding distinct stem-loop precursors, pre-miR- 128-1 and pre-miR-128-2, that generate identical mature microRNAs after processing. Using in situ hybridization and Northern blot analysis, we were able to confirm that the mature form of the microRNA increases substantially during development. Unexpectedly, we found that pre-miR-128-1 cannot be detected by either method. In clear contrast to this result, expression of the pre-miR-128-2 precursor remains constant and high from early embryonic stages to adulthood. Moreover, the in situ hybridizations for miR-128 and pre-miR-128-2 show that there is a differential localization of the mature and the precursor forms. All cells that express mature miR-128 also express pre-miR-128-2. However, there are structures in the CNS, such as cortical layer V, or the progenitor zones of the embryonic cortex, the Rostral Migratory Stream (RMS) and the adult subgranular zone of the dentate gyrus, that are pre- miR-128-2 positive and mature miR-128 negative. Together, these discrepancies are evidence for post-transcriptional regulation of miR-128. Mechanisms of post-transcriptional regulation of microRNA expression are still largely unexplored, and our data reveal a significant role for such mechanisms in the regulation of miR-128. Because miR-128 expression increases both during neuronal maturation in vitro and dur- ing brain development in vivo, we asked which functions miR-128 performs in these processes and in the mature brain. Using primary cell culture, we showed that premature miR-128 gain of function in polarized neurons leads to growth of supernumerary axons. We tested several pathways involved in neuronal polarization or in the maintenance of axon dominance that might be altered under gain of function conditions. However, we were unable to suppress the multiple axons phenotype by manipulating classical regulators of neurite outgrowth such as Cdc42, Rac1 and RhoA, components of the polarity complex (Par6b), or the semaphorin pathway (Nrp2). We therefore decided to complement the in vitro studies with functional assessment of miR-128 functions in vivo. Guided by our expression analysis, we used in utero electroporation to manipulate miR-128 expression in progenitors for upper layer neurons. We assayed for effects on neuronal migration, dendritogenesis and spine morphology. We found that neurons ectopically expressing pre-miR-128-2, but not pre-miR-128-1, do not migrate to the correct position in the upper layers of the cortex. The affected neurons maintain their identity as upper layer neurons even though they are scattered throughout the cortical layers and the white matter. We were able to rescue this migration impairment by coex- pressing pre-miR-128-2 and Phf6. We showed that miR-128 is an important regulator of Phf6, a nuclear/nucleolar protein that is mutated in Börjeson- Forssman-Lehmann Syndrome, a developmental disorder associated with mental retardation and epilepsy. Pre-miR-128-2 gain-of-function also affected dendritogenesis and spine morphology. Neurons expressing pre- miR-128-2 show a less complex dendritic arbor and fewer and bigger dendritic spines. In summary, my results indicate that miR-128 is a pleiotropic microRNA that regulates the expression of multiple genes, including the human disease gene Phf6, to influence axonal outgrowth, neuronal migration and structural connectivity during mouse brain development.

MicroRNAs stellen einen evolutionär konservierten Mechanismus zur Kontrolle von mRNA Translation dar. Die Genome lebender Organismen besitzen hunderte verschiedener microRNA- Gene, die jeweils spezifische Signalwege regulieren können. Der Fokus dieser Arbeit lag auf der Untersuchung einer spezifischen microRNA: miR-128. Zu Beginn der Arbeit war ledig- lich bekannt, dass miR-128 eine der am häufigsten vertretenen miRNAs im Gehirn ist und ausschließlich in Neuronen exprimiert wird. Mit fortschreitender embryonaler und postnataler Entwicklung des Gehirns steigt die Expression von miR-128 deutlich an. Es existieren zwei miR-128 Gene, die für jeweils zwei verschiedene miR-128 Vorläuferfor- men, miR-128-1 und miR-128-2, codieren. Beide Haarnadel- förmigen Vorläufer-microRNAs erzeugen nach ihrer Prozessierung die identische reife microRNA. Mittels in situ Hybridisie- rung sowie Northern Blot konnte der bereits beschriebene Anstieg an reifer miR-128 während der Entwicklung bestätigt werden. Überraschenderweise konnte jedoch mit beiden Methoden keine pre-miR-128-1 Expression gezeigt werden. Im Gegenteil hierzu konnte eine konstante und hohe Expression des miR-128-2 Vorläufers in frühen embryonalen Stadien bis hin zum adulten Tier nachgewiesen werden. Zudem zeigten in situ Hybridisierungen für miR-128 und pre-miR- 128-2 eine unterschiedliche Lokalisierung von reifer und Vorläufer-Form. Alle Zellen, die die reife miR-128 Form exprimieren sind ebenfalls positiv für die Vorläufer-Form. In bestimmten Bereichen des zentralen Nervensystems, wie der Lamina fünf des Kortex, der Vorläufer-Zone des embryonalen Kortex, dem rostralen Migrationsstrom und der Subgranulärzone des Gy- rus Dentatus, findet man jedoch Zellen, die positiv für die miR-128 Vorläufer-Form, jedoch negativ für die reife Form, sind. Diese Diskrepanz deutet auf eine post-transkriptionelle Regu- lation der miR-128 Expression hin. Mechanismen der post- trankriptionellen Regulation von miRNA Expression sind größtenteils unbekannt. Die hier vorgestellten Ergebnisse deuten auf eine wichtige Rolle solcher Mechanismen in der Regulation von miR-128 hin. Aufgrund des starken Anstiegs der miR-128 Expression bei der neuronalen Differenzie- rung in vitro und während der Entwicklung des Gehirns sollte die Frage beantwortet werden, welche Rolle miR-128 in diesen Prozessen spielt. Mit Hilfe primärer Neuronenkulturen konnte gezeigt werden, dass ektopische miR-128 überexpression in bereits polarisierten Neuronen zur Ausbildung überzähliger Axone führt. Verschiedene Signalwege, wichtig für die neuronale Po- larisierung sowie Erhaltung der Axon-Dominanz, wurden auf Veränderungen unter miR-128 überexpression untersucht. Durch Manipulation klassischer Regulatoren für die Ausbildung von Neuriten (Cdc42, Rac1, RhoA), Komponenten des Polarisierungskomplexes (Par6b) oder des Semaphorin Signalweges (Nrp2) konnte der „multiple-Axon-Phänotyp“ jedoch nicht un- terdrückt werden. Aufgrund dessen wurden die durchgeführten in vitro Studien durch Experimente ergänzt, die die Funktion von miR-128 in vivo aufklären sollten. Basierend auf der Expressionsanalyse wurde mit Hilfe von in utero Elektroporation die miR-128 Expression in Vorläuferzellen für Neurone der oberen Kortexschichten manipuliert. Die entstandenen Neurone wurden auf Effekte bei der Migration, der Ausbildung der Dendri- ten und auf ihre Spine Morphologie hin untersucht. Die Ergenbisse zeigten, dass Neurone die ektopisch pre-miR-128-2 überexprimieren, nicht bis zu ihrer korrekten Position in den oberen Schichten des Kortex wandern. Ektopische pre-miR-128-1 Expression zeigte hingegen keinen Effekt. Trotz der Tatsache, dass die betroffenen Neuronen über alle Kortexschichten und die weiße Substanz verteilt sind, behalten sie ihre Identität als Neurone der oberen Kortexschich- ten. Dieses Migrationsdefizit konnte durch Ko-Expression von pre-miR-128-2 zusammen mit Phf6 aufgehoben werden. Dies zeigt, dass miR-128 ein wichtiger Regulator von Phf6 ist. Phf6 ist ein nukleäres und nukleoläres Protein, welches im Börjeson-Forssman- Lehmann Syndrom, einer mit mentaler Retardierung und Epilepsie assoziierter Entwicklungsstörung, mutiert ist. miR-128 überexprimierende Neurone zeigten ebenfalls weniger komplexe Dendritenbäume so- wie weniger und größere dendritische Spines. Zusammenfassend deuten meine Ergebnisse darauf hin, dass es sich bei miR-128 um eine pleiotrope miRNA handelt, welche die Expression mehrerer Gene, eingeschlossen Phf6, steu- ert um Axon-Ausbildung, neuronale Migration und strukturelle Konnektivität während der Entwicklung des Mausgehirns zu beeinflussen.