dc.contributor.author
Werner, Andrea
dc.date.accessioned
2018-06-07T22:34:38Z
dc.date.available
2013-09-25T08:06:43.431Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/9408
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-13607
dc.description
Inhaltsverzeichnis
.....................................................................................................................III
Abbildungsverzeichnis
.............................................................................................................VI
Tabellenverzeichnis...............................................................................................................
VIII Abkürzungsverzeichnis
............................................................................................................IX
1 Zusammenfassung
.................................................................................................................1
2 Einleitung
...............................................................................................................................3
2.1 Der
Stickstoffkreislauf......................................................................................................3
2.1.1 Stickstoffaufnahme in
Pflanzen.................................................................................5
2.1.1.1.
Stickstofffixierung.............................................................................................5
2.1.2
Stickstoffrecycling.....................................................................................................8
2.1.3
Purinabbau.................................................................................................................8
2.1.3.1 Von den Nukleotiden zu Xanthin
.......................................................................9
2.1.3.2 Vom Xanthin zu den
Ureiden.............................................................................9
2.1.3.3 Vom Allantoin zu Glyoxylat
..............................................................................9
2.1.3.3.1 Identifizierung der beteiligten Enzyme
.....................................................11 2.1.3.3.2
Kristallstrukturen der beteiligten
Enzyme.................................................12 2.1.3.3.3 Kofaktoren
der beteiligten
Enzyme...........................................................13 2.1.3.3.4
Endprodukte der beteiligten Enzyme
........................................................15 2.1.3.3.5
Lokalisation der beteiligten Enzyme
.........................................................15 2.1.3.3.6
Transport....................................................................................................16
2.1.3.3.7 Ureide und
Stress.......................................................................................18
2.1.3.3.8 Ureide in Sojabohne
..................................................................................18
2.2 Vorgeschichte im Labor
.................................................................................................21
2.3 Ziel der Arbeit
................................................................................................................22
3 Material und Methoden
......................................................................................................23
3.1
Material...........................................................................................................................23
3.1.1 Verwendete Nährmedien
.........................................................................................23
3.1.2 Verwendete Konstrukte
...........................................................................................24
3.1.3 Verwendete Bakterien und Viren
............................................................................26
3.1.4 Verwendete
Pflanzen...............................................................................................27
3.1.5 Verwendete Datenbanken und Programme
.............................................................28 3.2
Methoden........................................................................................................................29
3.2.1 Molekularbiologische
Methoden.............................................................................29
3.2.1.1 Klonierung von Konstrukten
............................................................................29
3.2.1.1.1 Zur Überexpression in Pflanzen
................................................................29 3.2.1.1.2
Zur Überexpression in E.
coli....................................................................30
3.2.1.2 Transformationen
.............................................................................................32
3.2.1.2.1 Von
Bakterien............................................................................................32
3.2.1.2.2 Von Pflanzen
.............................................................................................33
3.2.2 Biochemische Methoden
.........................................................................................34
3.2.2.1 Proteinexpression
.............................................................................................34
3.2.2.1.1 In E. coli
....................................................................................................34
3.2.2.1.2 In
Pflanzen.................................................................................................35
3.2.2.2 Proteinaufreinigung
..........................................................................................35
3.2.2.2.1 Aus E. coli
.................................................................................................35
3.2.2.2.2 Aus
Pflanzen..............................................................................................38
3.2.2.3 Proteinkonzentrationsbestimmung
...................................................................39 3.2.2.4
Proteindetektion................................................................................................40
3.2.2.4.1
Gelelektrophorese......................................................................................40
3.2.2.4.2 Proteinfärbungen im Gel
...........................................................................40
3.2.2.5 Proteinaktivitätsbestimmung
............................................................................42
3.2.2.5.1 Kolorimetrische
Nachweisreaktionen........................................................43
3.2.2.5.2 Polarimetrie
...............................................................................................45
3.2.2.5.3 NMR
..........................................................................................................46
3.2.3 Pflanzenphysiologische
Methoden..........................................................................46
3.2.3.1
Pflanzenanzucht................................................................................................46
3.2.3.1.1 Von Nicotiana
benthamiana......................................................................47
3.2.3.1.2 Von Arabidopsis
thaliana..........................................................................47
3.2.3.1.3 Von Glycine max
.......................................................................................47
3.2.3.2 Phänotypenanalyse in
Arabidopsis...................................................................48
3.2.3.3
Metabolitanalyse...............................................................................................49
3.2.3.3.1 In Arabidopsis thaliana
.............................................................................49
3.2.3.3.2 In Glycine
max...........................................................................................51
3.2.3.4 Natives
Proteinniveau.......................................................................................52
3.2.3.4.1 In Arabidopsis thaliana
.............................................................................53
3.2.3.4.2 In Glycine
max...........................................................................................53
4 Ergebnisse
............................................................................................................................54
4.1 Der Ureidabbau
allgemein..............................................................................................54
4.1.1 Identifizierung und Charakterisierung ureidabbauender Enzyme
...........................54 4.1.1.1 Vom Allantoat zum Ureidoglykolat
.................................................................54 4.1.1.1.1
Der AAH –
Weg........................................................................................54
4.1.1.1.2 Der ALC –
Weg.........................................................................................63
4.1.1.2 Vom Ureidoglykolat zum Glyoxylat
................................................................65 4.1.1.2.1
Der UAH –
Weg........................................................................................65
4.1.1.2.2 Der UUH –
Weg........................................................................................67
4.1.1.3 Der vollständige Abbau des Allantoats
............................................................68 4.1.1.3.1 Der
Allantoatabbau in E. coli
....................................................................69
4.1.1.3.2 Der Allantoatabbau in Arabidopsis
thaliana.............................................71 4.2 Der Ureidabbau in
Arabidopsis
thaliana........................................................................72
4.2.1 Die beteiligten Enzyme
...........................................................................................72
4.2.2 Subzelluläre Lokalisation
........................................................................................75
4.2.3 Komplexbildung der
Enzyme..................................................................................76
4.2.4 In vivo Funktion und Relevanz der
Enzyme............................................................78 4.2.4.1
Phänotypenanalyse
...........................................................................................78
4.2.4.2
Metabolitanalyse...............................................................................................83
4.2.5 In vivo Proteingehalt der
Enzyme............................................................................86
4.3 Der Ureidabbau in anderen
Pflanzen..............................................................................87
4.3.1 Die ureidabbauenden Enzyme aus
Reis...................................................................88
4.3.2 Die ureidabbauenden Enzyme aus
Sojabohne.........................................................92 4.3.2.1
Die beteiligten Enzyme I
..................................................................................92
4.3.2.2 In vivo Funktion I
.............................................................................................93
4.3.2.3 Die beteiligten Enzyme
II.................................................................................95
4.3.2.4 In vivo Funktion II und in vivo Relevanz
.........................................................98 4.3.2.5 In vivo
Proteingehalt & Metabolitprofil
.........................................................102 5
Diskussion...........................................................................................................................106
5.1 Die Enzyme
..................................................................................................................107
5.2 Ureidabbau in Pflanzen
................................................................................................110
5.3 In vivo Funktion und Relevanz
....................................................................................114
5.4 Die Enzyme der Sojabohne
..........................................................................................116
5.5 Der Ureidabbau
allgemein............................................................................................117
5.6
Ausblick........................................................................................................................118
6
Anhang................................................................................................................................121
7 Literatur
.............................................................................................................................132
Lebenslauf
..............................................................................................................................140
Publikationen und Kongresse
.................................................................................................141
Danksagung
............................................................................................................................142
dc.description.abstract
Die Verfügbarkeit von Stickstoff im Boden begrenzt häufig das pflanzliche
Wachstum. Daher ist neben der Stickstoffaufnahme auch die Wiederverwertung und
Umverteilung vorhandener Stickstoffreserven während der pflanzlichen
Entwicklung wichtig. In Pflanzen trägt der Purinabbau zum Stickstoffrecycling
bei. Darüber hinaus sichert er in tropischen Leguminosen unter fixierenden
Bedingungen die primäre Stickstoffversorgung der Pflanze. Die Ureide Allantoin
und Allantoat sind Zwischenprodukte des Purinabbaus und stellen die
Transportform des durch Fixierung erhaltenen Stickstoffs in tropischen
Leguminosen dar. Dies ist die erste Arbeit, in der mit aufgereinigten Enzymen
aus Pflanzen und Bakterien ein vollständiger Ureidabbau in vitro erreicht
werden konnte. Dies wurde durch die Identifizierung eines neuen Enzyms, der
Ureidoglycin Aminohydrolase (UGlyAH), ermöglicht. Es konnte gezeigt werden,
dass Ureidoglycin das Reaktionsprodukt der Allantoat Amidohydrolase (AAH) ist,
welches dann durch die Aktivität der UGlyAH zu Ureidoglykolat umgesetzt wird.
Dieser Schritt erzeugt das Substrat der pflanzlichen Ureidoglykolat
Amidohydrolase (UAH) oder bakteriellen Ureidoglykolat Urea Hydrolase (UUH).
Durch die Anwesenheit dieser drei Enzyme wird Allantoat vollständig zu
Glyoxylat abgebaut, wobei der Purinringstickstoff von den pflanzlichen Enzymen
als Ammoniak freigesetzt wird. Die UGlyAH aus Arabidopsis thaliana wurde wie
auch die anderen ureidabbauenden Enzyme zuvor im ER lokalisiert. Damit finden
die letzten Schritte des Purinabbaus im ER statt. Die in vivo Funktion und
Relevanz der ureidabbauenden Enzyme in Pflanzen wurde mittels Phänotypen- und
Metabolitanalyse der entsprechenden T-DNA Insertionslinien für Arabidopsis
thaliana gezeigt. Dies gelang für die GmUAH aus der tropischen Leguminose
Sojabohne (Glycine max) mittels Virus-induzierter Genabschaltung (VIGS).
Darüber hinaus wurde der native Proteingehalt der ureidabbauenden Enzyme in
verschiedenen Geweben von Arabidopsis und Sojabohne unter Verwendung
spezifischer Antikörper untersucht. Dabei wurde eine unterschiedliche
Regulation während des Blattalterungsprozesses festgestellt, wohingegen die
Stickstoffquelle in beiden Pflanzen keinen sichtbaren Einfluss auf den
Proteingehalt der ureidabbauenden Enzyme ausübte.
de
dc.description.abstract
Plant growth is often limited by nitrogen availability in the soil. Not only
do plants depend on efficient nitrogen uptake, they also require effective
means to internally redistribute nitrogen during every stage of development.
The purine degradation pathway contributes to this nitrogen recycling in
plants. In tropical legumes it is also of central importance to the plants’
nitrogen supply under nitrogen-fixing conditions. This is the first time that
the complete ureide degradation pathway has been demonstrated in vitro with
purified enzymes from plants and bacteria. This was enabled by the
identification of the novel enzyme ureidoglycine aminohydrolase (UGlyAH). It
is shown that ureidoglycine is the reaction product of allantoate
amidohydrolase (AAH), and is in turn metabolised by the UGlyAH to
ureidoglycolate. This reaction produces the substrate of the plant
ureidoglycolate amidohydrolase (UAH) or bacterial ureidoglycolate urea
hydrolase (UUH). The conversion of allantoate to glyoxylate can be achieved by
these three enzymes. During these reactions the total nitrogen of the purine
ring is released as ammonia in plants. The UGlyAH from Arabidopsis thaliana is
shown to be localised in the ER where all the other ureide degrading enzymes
have previously been localised. This shows that the last steps of the purine
degradation pathway take place in the ER. The in vivo function and relevance
of the ureide degrading enzymes in plants was shown by phenotype and
metabolite analyses using the corresponding T-DNA insertion lines of
Arabidopsis thaliana and virus-induced gene silencing (VIGS) in soybean
(Glycine max) for GmUAH. The native protein level of the ureide degrading
enzymes was investigated in several tissues of arabidopsis and soybean using
specific antibodies. It was found to be differentially regulated during leaf
aging. In contrast, the nitrogen source had no obvious impact on the protein
levels in either plant.
en
dc.format.extent
X, 143 S.
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
ureidoglycolate
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie::572 Biochemie
dc.title
Biochemische und physiologische Charakterisierung des pflanzlichen Purinabbaus
dc.contributor.contact
andreawerner82@yahoo.de
dc.contributor.firstReferee
PD Dr. Claus-Peter Witte
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Tina Romeis
dc.date.accepted
2012-10-30
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000094978-9
dc.title.translated
Biochemical and physiological characterisation of the purine degradation
pathway in plants
en
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000094978
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000013997
dcterms.accessRights.dnb
free
dcterms.accessRights.openaire
open access
