Mechanismen und pathophysiologische Konsequenzen einer hypoxievermittelten Expression des Wilmstumor-Transkriptionsfaktors WT1 in Herzmuskelgefäßen

Abstract

Neben seiner Funktion als Tumorsuppressor ist das Wilmstumorgen WT1 für die normale Embryogenese erforderlich. Mausembryonen mit inaktiviertem Wt1 Gen (Wt1-/-) weisen u.a. eine gestörte Herzmuskelentwicklung auf, die durch ein hypoplastisches Ventrikelmyokard charakterisiert ist. Ursache für den myokardialen Phänotyp ist bei den Wt1-/- Embryonen wahrscheinlich ein partieller Defekt des Epikards, dem regulären Ort der Wt1-Expression im Herzmuskel. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, daß die Expression von Wt1 nach experimentellem Myokardinfarkt bei Ratten aktiviert ist. Im Vergleich zum intakten rechtsventrikulären Gewebe, war Wt1 im infarzierten linken Ventrikel zwischen dem 1. Tag und der 9. Woche nach Ligation der linken Koronararterie um mehr als das Doppelte erhöht. Mittels mRNA in situ Hybridisierung und immunhistochemischer Verfahren konnte nachgewiesen werden, dass Wt1 nach Myokardinfarkt nicht mehr auschließlich epikardial vorkommt, sondern auch in den infarktnahen Blutgefäßen exprimiet wird. Die Wt1-positiven Gefäßzellen konnten als Endothel- und glatte Muskelzellen identifiziert werden. Eine auffallend ähnliche Verteilung wiesen der vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktor VEGF und die zellulären Proliferationsmarker PCNA bzw. PECAM-1/CD31 in den Koronargefäßen des ischämischen Herzens auf. Ähnlich der Wirkung einer regionalen Gewbeischämie konnte eine vaskuläre Expresssion von Wt1 im Herzmuskel auch durch systemische Exposition von Ratten bei 8% O2 bzw. 0.1% CO ausgelöst werden. An Zellkulturen wurde der Mechanismus der sauerstoffabhängigen Regulation von WT1 näher untersucht. Die WT1-Expression wurde sowohl in einer Ostosarkomlinie (U2OS) als auch in lymphoblastären Zellen (Reh) durch Hypoxie (1% O2) und hypoxieähnliche Maßnahmen (Inkubation in Gegenwart von 100 µM CoCl2 bzw. Desferrioxamin) stimuliert. Mit Hilfe von Reportergenassays konnte nachgewiesen werden, dass der Promotor der Wt1-Gens durch Hypoxie induzierbar ist. Der hypoxieempfindliche Bereich im Wt1-Promotor wurde mittels gezielter Mutagenese und anhand von Gelshiftexperimenten als klassische Bindungsstelle für hypoxieinduzierbaren Faktor-1 (HIF-1) identifiziert. Diese Resultate zeigen, dass lokale Gewebeischämie und Sauerstoffmangel die Expression von Wt1 in den Blutgefäßen des Herzmuskels stimulieren. Als ein Vermittler der Hypoxiewirkung spielt der Transkriptionsfaktor HIF-1 eine wichtige Rolle. Die enge Assoziation mit Vaskulogenesefaktoren im ischämischen Herzmuskel deutet darauf hin, dass WT1 für die transkriptionelle Kontrolle der myokardialen Vaskularisation von Bedeutung sein könnte. Diese Möglichkeit wird durch den kürzlich erbrachten Nachweis gestützt, dass WT1 für die Vaskulogenese im embryonalen Myokard notwendig ist. Die Identifizierung molekularer WT1-Zielgene bei der Vaskularisation des Herzmuskels wird eine sowohl aus grundlagenwissenschaftlicher Sicht als auch aus klinischer Perspektive interessante Herausforderung für zukünftige Arbeiten darstellen.

In addition to its function as a tumor suppressor, the Wilms tumor gene WT1 is critical for normal embryogenesis. Murine embryos with inactivated Wt1 gene (Wt1-/-) show i.a. developmental defects of the heart, characterized by a hypoplastic ventricular myocardium, presumably caused by a partial defect of the epicardium, the physiological site of Wt1 expression in the heart. Here, an activation of Wt1 expression after experimentally induced myocardial infarction could be shown. In comparison to intact right ventricular tissue, Wt1 mRNA was elevated more than 2-fold in the infarcted left ventricles of rat hearts between 1 day and 9 wks after experimentally induced myocardial infarction. Wt1 expression was localized by means of mRNA in situ hybridization and immunohistochemistry to vascular endothelial and vascular smooth muscle cells within the border zone of the infarcted tissue. A strikingly similar distribution was seen for vascular endothelial growth factor and two different cell proliferation markers (PCNA, PECAM-1) in the coronary vessels of the ischemic heart. Wt1 expression could be mimicked by systemic exposure of rats to normobaric hypoxia (8% O2) and 0.1% CO, respectively. The mechanism of oxygen-dependent regulation of WT1 was further characterized in an in vitro cell culture model. WT1 expression was stimulated in an osteosarcoma cell line (U2OS) and in lymphoblastic cells (Reh) by exposition to hypoxia (1% O2) and hypoxia-like conditions (in the presence of CoCl2 and desferrioxamine), respectively. Using reporter gene assays, the Wt1 promoter could be characterized as hypoxia-inducible. The hypoxia-responsive element of the WT1 promoter could be identifed as a classical binding site for hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1) by means of site-directed mutagenesis and gel shift assays. These results demonstrate a stimulation of Wt1 expression in myocardial vessels by local tissue ischemia and systemic hypoxia. The transcription factor HIF-1 plays an important role as a mediator of the effects of hypoxia/ischemia. The close temporal and spatial association with vasculogenic factors in the ischemic myocardium indicates a a role of WT1 in the transcriptional control of myocardial neovascularization. This assumption is supported by the recently provided evidence of the important role played by WT1 during vasculogenesis in the embryonic myocardium. The identification of WT1 target genes during myocardial vascularization will be an interesting challenge for future research projects from a basic research as well as clinical point of view.