Molecular mechanisms of the dermal immune response: cooperation between Toll-like receptors and Sphingosine-1-phosphate in fibroblasts

Abstract

Normal human dermal fibroblasts are important regulators of inflammatory and immune responses in the skin. TLRs play an essential role in recognition of microbial patterns and activation of immune system. Sphingosine-1-phosphate (S1P) is a critical regulator of many physiological and pathophysiological processes and significantly induces pro-inflammatory cytokines time- and concentration-dependently in dermal fibroblasts. The cooperation of TLRs and S1P are important in regulation of immune responses and has been investigated in this work. TLR2 ligation strongly enhances the production of the pro- inflammatory cytokines IL-6 and IL-8 in dermal fibroblasts. The IL-6 and IL-8 release is decreased after blocking with JTE-013 (S1P2 antagonist) and CAY10444 (S1P3 antagonist) as well as siRNA knockdown of S1P2 and S1P3, indicating that secretion of cytokines is mainly mediated through S1P2 and S1P3. The TLR2/1 agonist Pam3CSK4 and S1P or TGF-β markedly up-regulate IL-6 and IL-8 secretion. Pam3CSK4 and S1P alone promote myofibroblast differentiation as assessed by significant increases of α-smooth muscle actin and collagen I expression. Importantly, co-stimulation of Pam3CSK4 but not poly(I:C) with S1P (≥1 μM) induces differentiation into myofibroblasts. In contrast, Pam3CSK4 and low S1P concentrations (<1 μM) accelerate cell migration. These results suggest that TLR2/1 signaling and S1P cooperate in pro-inflammatory cytokine production and myofibroblast differentiation and promote cell migration of skin fibroblasts in a S1P concentration-dependent manner. The cellular levels of S1P are regulated by activation of degradation (sphingosine phosphatases and sphingosine lyase) and synthesis (sphingosine kinases) enzymes. Dysregulation of S1P metabolism has been implicated in cancer and inflammatory diseases but the role of TLRs on regulation of S1P levels is poorly understood. In the second part of this study the role of TLRs, TGF-β and exogenous S1P on the regulation of S1P metabolizing enzymes in normal human dermal fibroblasts was investigated. Interestingly, TLR signaling induces SPP1 and SphK1 gene and protein expression, however, activation of TLRs decreases S1P and increases sphingosine levels intra- and extracellularly, suggesting that SPP1 is more important in the regulation of S1P metabolism. TLR2/1, TLR3 and TLR9 agonists time-dependently regulate SPP1 expression with a peak after 3 h which is moderately decreased after 24 h. Importantly, TGF-β or exogenous S1P in combination with the TLR2/1 ligand (Pam3CSK4) induce SPP1 and SphK1 expression. In addition, TLR2, TLR3 and TLR9 together with TGF-β lead to up-regulation of SPP1. Although the obtained results are not expressive for the functionality of enzymes and TLR effects, but they present the information about alterations in sphingolipid metabolism at the gene level which may benefit the illustration of further studies in this context. The blockade of SphK1 differentially regulates cytokine release in various cells. Notably, SphK1 inhibition in dermal fibroblasts further increases secretion of pro-inflammatory cytokines IL-6 and IL-8 in TLR9-stimulated cells while cytokine levels remained unchanged after TLR3 activation and slightly decreased after TLR2/1 ligation. This difference might be due to activation of different signaling pathways after TLRs ligation and upon inhibition of SphKs. Taken together, these findings demonstrate that the intermediation between TLRs, exogenous S1P and TGF-β plays regulatory role in the expression of S1P metabolizing enzymes as well as pro-inflammatory cytokines, fibroblasts differentiation and migration which may provide insight into the contribution of infectious signals and sphingolipids in dermal inflammation and tissue repair.

Normale humane dermale Fibroblasten sind wichtige Regulatoren entzündungs- und immunregulatorischer Prozesse der Haut. Toll-like Rezeptoren (TLRs) sind maßgeblich an der Erkennung mikrobieller Strukturen und der Aktivierung des Immunsystems beteiligt. Sphingosin-1-phosphat (S1P) reguliert viele physiologische und pathophysiologische Prozesse der Haut und induziert zeit- und konzentrationsabhängig pro-inflammatorische Zytokine. Die Aktivierung des TLR2 fördert in normalen Fibroblasten die Produktion der pro-inflammatorischen Zytokine IL-6 und IL-8. Die Blockade des S1P2 mittels JTE-013, die Blockade des S1P3 mittels CAY10444 oder der siRNA Knockdown beider Rezeptoren reduziert signifikant die IL-6 und IL-8-Freisetzung, daher wird die IL-6 und IL-8 Sekretion maßgeblich durch S1P2 und S1P3 vermittelt. Die Kombination des TLR2/1 Agonisten Pam3CSK4 mit S1P als auch mit TGF-β erhöhen die IL-6 und IL-8 Freisetzung. Der Nachweis von α-smooth muscle actin und Collagen I deutet auf eine Differenzierung von Fibroblasten in Myofibroblasten durch Pam3CSK4 oder S1P. Die Kombination von S1P (≥1 µM) mit Pam3CSK4 induzierte ebenfalls die Differenzierung in Myofibroblasten, welche nicht durch die Kombination mit poly(I:C) gelang. Dagegen förderte die Kombination geringer Dosen S1P (<1 µM) mit Pam3CSK4 die Migration der dermalen Fibroblasten. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass TLR2/1 Signalwege und S1P bei der Produktion pro- inflammatorischer Zytokine, in der Differenzierung von Fibroblasten in Myofibroblasten und bei der Förderung der Zellmigration S1P- konzentrationsabhängig zusammenarbeiten. Die zytosolischen S1P-Konzentrationen werden durch die Aktivierung abbauender (SPPs und SPL) sowie aufbauender (SphKS) Enzyme reguliert. Ohne die Bedeutung von TLRs auf die Regulation von S1P-Konzentrationen zu kennen, wird die Dysregulation des S1P-Metabolismus mit neoplastischen und immunologischen Erkrankungen assoziiert. In der vorliegenden Arbeit wurde die Bedeutung von TLR-Signalwegen, von TGF-β und von exogenem S1P auf die Regulation der S1P-metabolisierenden Enzyme in normale Fibroblasten untersucht. Interessanterweise induzieren TLRs die SPP1 und SphK1 Gen- und Proteinexpression. Die Aktivierung von TLRs senkt die S1P und erhöht die Sphingosin Konzentrationen intra- und extrazellulär. Dies deutet darauf hin, dass SPP1 einen größeren Einfluss auf den S1P-Metabolismus hat als SphK1. TLR2/1, TLR3 und TLR9 Agonisten regulieren zeitabhängig die SPP1 Expression: maximale Expression wurde nach dreistündiger Inkubation beobachtet, die innerhalb einer maximalen Inkubationsdauer von 24 Stunden leicht zurückging. Pam3CSK4, der TLR2/1 Ligand, induziert in Kombination mit TGF-β oder exogenem S1P die SPP1 und SphK1 Expression. TLR2, TLR3 und TLR9 induzieren zusammen mit TGF-β ebenfalls SPP1. Die erzielten Ergebnisse lassen zwar keine Aussage zur Funktionalität der Enzyme zu, geben aber erste Hinweise auf die Veränderungen im Sphingolipidstoffwechsel und dienen als Anhaltspunkt für weitere Studien auf diesem Gebiet. Die SphK1-Inhibition reguliert die Zytokinfreisetzung zellartabhängig. SphK1-Inhibition in TLR9-stimulierten normal Fibroblasten steigert die Sekretion der pro-inflammatorischen Zytokine IL-6 und IL-8, wohingegen TLR3-stimulierte Fibroblasten keine Veränderung aufwiesen und die IL-6-/IL-8-Sekretion in TLR2/1-stimulierten Zellen leicht abnahm. Dieser Unterschied könnte durch Aktivierung verschiedener Signalwege nach TLR-Bindung und SphK-Inhibition begründet sein. Die Ergebnisse des zweiten Teils meiner Arbeit demonstrieren, dass die Vermittlung zwischen TLRs, TGF-β und exogenem S1P sowohl eine regulierende Rolle in der Expression der S1P-metabolisierenden Enzyme als auch bei der Freisetzung pro-inflammatorischer Zytokine spielt. Dies ist für die Erklärung von mikrobiellen Einflüssen und von Sphingolipiden auf dermale Entzündungsprozesse und Wundheilung interessant.