dc.contributor.author
Symmank, Hanka
dc.date.accessioned
2018-06-07T22:33:38Z
dc.date.available
2002-05-10T00:00:00.649Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/9396
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-13595
dc.description
Titelblatt
Abkürzungsverzeichnis
1 Einleitung und Problemstellung
2 Grundlagen und Theorie
2\. 1 Modulare Organisation der nichtribosomalen Peptidsynthetasen
2\. 2 Der Multienzym Thiotemplate Mechanismus
2\. 3 Die funktionellen Domänen der nichtribosomalen Peptidsynthetasen
2\. 4 Die Surfactin-Synthetase
3 Material
3\. 1 Mikroorganismen
3\. 2 Plasmide
3\. 3 Primer für die Polymerasekettenreaktion
3\. 4 Chemikalien, Enzyme, Kits und Größenmarker
3\. 5 Apparative Ausstattung und sonstige Materialien
3\. 6 Medien, Agarplatten und Antibiotika
3\. 7 Puffer und Lösungen
4 Methoden
4\. 1 Aufbewahrung und Anzucht von Bakterien
4\. 2 Methoden zur Isolierung, Analyse, Amplifikation und Rekombination von
DNA
4\. 3 Methoden zur Isolierung und Charakterisierung von Proteinen
4\. 4 In vitro-Bestimmung enzymatischer Aktivitäten
4\. 5 In vivo-Biosynthese von Surfactin und -analoga
4\. 6 Synthese von 3-Hydroxytetradecanoyl-Coenzym A
4\. 7 Kristallisationsansätze
5 Ergebnisse
5\. 1 Enzymatische Charakterisierung der Acetyl-CoA-Synthetase von Lysobacter
sp. ATCC 53042
5\. 2 Enzymatische und strukturelle Charakterisierung der A-Domäne des
Glutaminsäure-aktivierenden Startmoduls der Surfactin-Synthetase Srf-M1
5\. 4 In vivo-Rekombination von Surfactin-Synthetase-Genen in B. subtilis und
Charakterisierung der resultierenden Deletions- und Austauschmutanten der
Surfactin-Synthetase
6 Diskussion
7 Literatur
8 Anhang
9 Veröffentlichungen und Präsentationen
dc.description.abstract
Infolge ihres modularen Organisationsprinzips verfügen die Nichtribosomalen
Peptidsynthetasen (NRPS) über ein enormes Potential bei der Entwicklung
innovativer neuer Wirkstoffe. Allerdings führte die Vernachlässigung
interdomänischer Wechselwirkungen beim Protein-Engineering in der
Vergangenheit zu zahlreichen Mißerfolgen. Ziel der vorliegenden Arbeit war es
daher, den Einfluß unterschiedlicher Rekombinationsstrategien auf die
einzelnen Enzymfunktionen systematisch zu untersuchen und so das nötige
Rüstzeug für die biokombinatorische Neuverknüpfung der NRPS bereitzustellen.
Alle Module setzen sich aus wiederkehrenden funktionellen Domänen zusammen,
die für die Adenylierung (A), Thioesterbindung (T) und Kondensation (C) der
Peptidaminosäuren verantwortlich sind. Als Trägern der Substratspezifität
kommt den A-Domänen eine Schlüsselrolle zu, der mit der detaillierten Analyse
von zwei Mitgliedern der adenylatbildenden Familie Rechnung getragen werden
sollte. Zum einen wurde dafür die autonom arbeitende Acetyl-CoA-Synthetase aus
Lysobacter sp. ATCC 53042 gewählt, bei der nicht nur eine außergewöhnlich hohe
Carbonsäuretoleranz festgestellt wurde, sondern überdies in Abhängigkeit von
der Liganden-Kombination beachtliche Differenzen zwischen den Hin- und
Rückreaktionen der zweistufigen Acyl-CoA-Synthese existierten. Zum anderen
wurde das erste Modul Srf-M1 der Surfactin-Synthetase aus B. subtilis ATCC
21332 charakterisiert, das außer seinem Hauptsubstrat L-Glutaminsäure keine
andere Aminosäure erkannte und aktivierte. Es besitzt zwei protease-sensitive
Regionen, die genau der Scharnierregion zwischen den A-Subdomänen sowie dem
Übergang von der C- zur A-Domäne entsprechen und vermutlich die Hauptursache
für das Scheitern umfangreicher Kristallisationsversuche sind. Im Hinblick auf
das Hauptanliegen wurden nunmehr systematisch verschiedene Surfactin-
Synthetase-Abschnitte und -Module neu miteinander verknüpft und der Einfluß
der verschiedenen Rekombinationsstrategien untersucht. Als Modellenzyme wurden
sowohl monomodulare Hybride aus den L-Valin- bzw. L-Leucin-aktivierenden
Modulen Srf-M4 und Srf-M7 als auch bimodulare Hybridsynthetasen aus den
L-Glutaminsäure- bzw. D-Leucin-aktivierenden Modulen Srf-M1 und Srf-M3 der
trimodularen Surfactin-Synthetase SrfA-A konstruiert, wobei die Fusionen
innerhalb aller drei Domänentypen A, T und C vorgenommen wurden. Von allen
untersuchten Fusionsstellen ergab nur die Rekombination innerhalb des
hochkonservierten His-Motivs eine voll funktionsfähige Peptidsynthetase,
dagegen konnten bei anderen Manipulationen wie z.B. in der Scharnierregion der
beiden A-Subdomänen oder im hochkonservierten T-Motiv nur noch Teilfunktionen
nachgewiesen werden. Nach Entfernung einer kompletten Moduleinheit produzierte
die hybride Surfactin-Synthetase von B. subtilis R13CDM in vivo entsprechend
ihrer neuen Programmierung nur noch ein Lipohexapeptid. Es wäre vorstellbar,
daß dieses Derivat vor allem wegen seiner geringeren Erythrocytentoxizität
eine geeignete Alternative für das Wildtyp-Surfactin werden könnte.
de
dc.description.abstract
Due to their modular organization nonribosomal peptide synthetases (NRPS)
offer a most promising target for the directed engineering of new bioactive
compounds. However, the ignoring of interdomain interactions led to many
failures in former module swapping experiments. Therefore this work was
focussed on the systematic evaluation of possible recombination sites on their
impact on distinct enzymatic functions to provide the required instruments for
the biocombinatorial reorganization of NRPS. Each module is at least composed
of three functional domains responsible for the adenylation (A), thioester
formation (T) and condensation (C) of the peptide amino acids. The A-domains
determine the substrate specificity and thus play a key role in this process.
This was taken into account by a detailed analysis of two members from the
adenylate forming family. At first the autonomously acting acetyl-CoA
synthetase from Lysobacter sp. ATCC 53042 was chosen, which accepts not only
an unusually broad range of carboxylic acid substrates, but also shows
considerable differences between the forward and reverse reactions of the two-
step acyl-CoA synthesis in dependence on the provided ligand combinations.
Secondly, the first module Srf-M1 of the surfactin synthetase from B. subtilis
ATCC 21332 was characterized which was unable to recognize and activate other
amino acids than its major substrate L-glutamic acid. It possesses two
protease-sensitive regions corresponding exactly to the previously found hinge
region dividing the A-domain into two subdomains as well as the linker area
between the C- and the adjacent A-domain. These flexible regions represent the
most obvious reasons for the failure of the extensive crystallization
attempts. In view of the main objective, the next step comprised the
systematic rearrangement of distinct surfactin synthetase fragments and
modules and the examination of the effects of the different recombination
strategies. As model enzymes both monomodular hybrids between the coding
regions of the L-valine and the L-leucine activating modules Srf-M4 and Srf-M7
and bimodular hybrid enzymes between the L-glutamic acid and the D-leucine
activating modules Srf-M1 and Srf-M3 from the trimodular surfactin synthetase
SrfA-A were generated in which fusion sites from all domain types A, T and C
were used. It was demonstrated that only recombinations within the highly
conserved His-motif resulted in a completely active peptide synthetase. By
contrast, only partial catalytic competence was preserved by other
manipulations like fusions within the hinge region between both A-subdomains
or within the highly conserved T-motif. After deletion of a complete module
unit the recombinant surfactin synthetase from B. subtilis R13CDM produced in
vivo only a lipohexapeptide according to its new programming. Because of the
reduced toxicity against erythrocytes it is conceivable that this derivative
will become a suitable alternative for the wild type surfactin.
en
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
peptide synthetases
dc.subject
peptide engineering
dc.subject
novel surfactin
dc.subject
surfactin synthetase
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::540 Chemie::540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften
dc.title
Funktionelle und strukturelle Charakterisierung bakterieller Peptidsynthetasen
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. Wolfram Saenger
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Joachim Vater
dc.date.accepted
2002-04-19
dc.date.embargoEnd
2002-05-13
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-2002000758
dc.title.subtitle
Peptid-Engineering durch kombinatorische Manipulation der Surfactin-Synthetase
dc.title.translated
Functional and structural characterization of bacterial peptide synthetases
en
dc.title.translatedsubtitle
Peptide engineeriengby combinatorial manipulation of surfactin synthetase
en
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000000644
refubium.mycore.transfer
http://www.diss.fu-berlin.de/2002/75/
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000000644
dcterms.accessRights.dnb
free
dcterms.accessRights.openaire
open access