Infolge ihres modularen Organisationsprinzips verfügen die Nichtribosomalen Peptidsynthetasen (NRPS) über ein enormes Potential bei der Entwicklung innovativer neuer Wirkstoffe. Allerdings führte die Vernachlässigung interdomänischer Wechselwirkungen beim Protein-Engineering in der Vergangenheit zu zahlreichen Mißerfolgen. Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, den Einfluß unterschiedlicher Rekombinationsstrategien auf die einzelnen Enzymfunktionen systematisch zu untersuchen und so das nötige Rüstzeug für die biokombinatorische Neuverknüpfung der NRPS bereitzustellen. Alle Module setzen sich aus wiederkehrenden funktionellen Domänen zusammen, die für die Adenylierung (A), Thioesterbindung (T) und Kondensation (C) der Peptidaminosäuren verantwortlich sind. Als Trägern der Substratspezifität kommt den A-Domänen eine Schlüsselrolle zu, der mit der detaillierten Analyse von zwei Mitgliedern der adenylatbildenden Familie Rechnung getragen werden sollte. Zum einen wurde dafür die autonom arbeitende Acetyl-CoA-Synthetase aus Lysobacter sp. ATCC 53042 gewählt, bei der nicht nur eine außergewöhnlich hohe Carbonsäuretoleranz festgestellt wurde, sondern überdies in Abhängigkeit von der Liganden-Kombination beachtliche Differenzen zwischen den Hin- und Rückreaktionen der zweistufigen Acyl-CoA-Synthese existierten. Zum anderen wurde das erste Modul Srf-M1 der Surfactin-Synthetase aus B. subtilis ATCC 21332 charakterisiert, das außer seinem Hauptsubstrat L-Glutaminsäure keine andere Aminosäure erkannte und aktivierte. Es besitzt zwei protease-sensitive Regionen, die genau der Scharnierregion zwischen den A-Subdomänen sowie dem Übergang von der C- zur A-Domäne entsprechen und vermutlich die Hauptursache für das Scheitern umfangreicher Kristallisationsversuche sind. Im Hinblick auf das Hauptanliegen wurden nunmehr systematisch verschiedene Surfactin- Synthetase-Abschnitte und -Module neu miteinander verknüpft und der Einfluß der verschiedenen Rekombinationsstrategien untersucht. Als Modellenzyme wurden sowohl monomodulare Hybride aus den L-Valin- bzw. L-Leucin-aktivierenden Modulen Srf-M4 und Srf-M7 als auch bimodulare Hybridsynthetasen aus den L-Glutaminsäure- bzw. D-Leucin-aktivierenden Modulen Srf-M1 und Srf-M3 der trimodularen Surfactin-Synthetase SrfA-A konstruiert, wobei die Fusionen innerhalb aller drei Domänentypen A, T und C vorgenommen wurden. Von allen untersuchten Fusionsstellen ergab nur die Rekombination innerhalb des hochkonservierten His-Motivs eine voll funktionsfähige Peptidsynthetase, dagegen konnten bei anderen Manipulationen wie z.B. in der Scharnierregion der beiden A-Subdomänen oder im hochkonservierten T-Motiv nur noch Teilfunktionen nachgewiesen werden. Nach Entfernung einer kompletten Moduleinheit produzierte die hybride Surfactin-Synthetase von B. subtilis R13CDM in vivo entsprechend ihrer neuen Programmierung nur noch ein Lipohexapeptid. Es wäre vorstellbar, daß dieses Derivat vor allem wegen seiner geringeren Erythrocytentoxizität eine geeignete Alternative für das Wildtyp-Surfactin werden könnte.
Due to their modular organization nonribosomal peptide synthetases (NRPS) offer a most promising target for the directed engineering of new bioactive compounds. However, the ignoring of interdomain interactions led to many failures in former module swapping experiments. Therefore this work was focussed on the systematic evaluation of possible recombination sites on their impact on distinct enzymatic functions to provide the required instruments for the biocombinatorial reorganization of NRPS. Each module is at least composed of three functional domains responsible for the adenylation (A), thioester formation (T) and condensation (C) of the peptide amino acids. The A-domains determine the substrate specificity and thus play a key role in this process. This was taken into account by a detailed analysis of two members from the adenylate forming family. At first the autonomously acting acetyl-CoA synthetase from Lysobacter sp. ATCC 53042 was chosen, which accepts not only an unusually broad range of carboxylic acid substrates, but also shows considerable differences between the forward and reverse reactions of the two- step acyl-CoA synthesis in dependence on the provided ligand combinations. Secondly, the first module Srf-M1 of the surfactin synthetase from B. subtilis ATCC 21332 was characterized which was unable to recognize and activate other amino acids than its major substrate L-glutamic acid. It possesses two protease-sensitive regions corresponding exactly to the previously found hinge region dividing the A-domain into two subdomains as well as the linker area between the C- and the adjacent A-domain. These flexible regions represent the most obvious reasons for the failure of the extensive crystallization attempts. In view of the main objective, the next step comprised the systematic rearrangement of distinct surfactin synthetase fragments and modules and the examination of the effects of the different recombination strategies. As model enzymes both monomodular hybrids between the coding regions of the L-valine and the L-leucine activating modules Srf-M4 and Srf-M7 and bimodular hybrid enzymes between the L-glutamic acid and the D-leucine activating modules Srf-M1 and Srf-M3 from the trimodular surfactin synthetase SrfA-A were generated in which fusion sites from all domain types A, T and C were used. It was demonstrated that only recombinations within the highly conserved His-motif resulted in a completely active peptide synthetase. By contrast, only partial catalytic competence was preserved by other manipulations like fusions within the hinge region between both A-subdomains or within the highly conserved T-motif. After deletion of a complete module unit the recombinant surfactin synthetase from B. subtilis R13CDM produced in vivo only a lipohexapeptide according to its new programming. Because of the reduced toxicity against erythrocytes it is conceivable that this derivative will become a suitable alternative for the wild type surfactin.