Einfluss der Bcl-2-Expression auf die Wirkung des Zytostatikums Hexadecylphosphocholin in HaCaT-Keratinozyten

Abstract

Das antiproliferative Alkylphosphocholin Hexadecylphosphocholin (HePC, Miltefosin) induziert Zelltod in verschiedenen Zelltypen. Diese membranaktive Substanz ist der Prototyp einer neuen Klasse von Tumormedikamenten, jedoch gibt es noch eine kontroverse Diskussion über ihren genauen Wirkmechanismus. In dieser Arbeit konnten wir zeigen, dass HePC in Mock- und Bcl-2-transfizierten HaCaT-Kreatinozyten sowie A375- und Mel-HO-Melanomzellen Zelltod induziert. Die Zellmorphologie von Zellen, die mit HePC behandelt wurden, hat sowohl apoptotisch als auch nekrotische Merkmale. Weiterhin wurde der intrazelluläre Apoptosemechanismus untersucht. In beiden HaCaT-Zelllinien konnte Cytochrom C-Freisetzung, Caspase-3-Aktivierung und DNA-Fragmentierung detektiert werden. Die Inhibition durch den Breitspektrum-Caspaseninhibitor zVAD und durch spezifische Caspase-3- bzw. Caspase-9-Inhibitoren reduzierte die DNA-Fragmentierung in Mock- und Bcl-2-transfizierten Zellen auf Kontrollniveau, trotzdem konnte noch ein Zelltod beobachtet werden. Die Inhibition der Caspase-8 zeigte eine zweifache Rolle. In Mock-transfizierten Zellen reduzierte sich die DNA-Fragmentierung erneut auf Kontrollniveau. In HaCaT/Bcl-2 waren die Fragmentierungswerte nur gering reduziert. In beiden Zelllinien war die de novo Ceramidgenerirung kein Bedingung für die DNA- Fragmentierung. Vier neu synthetisierte Sphigolipidanaloga zeigten ähnliche antiproliferative Eigenschaften wie HePC in HaCaT-Keratinozyten.

The antiproliferative alkylphosphocholine (APC) hexadecylphosphocholine (HePC, Miltefosine) induces cell death in a variety of cell types. This membrane active substance is the prototype for a promising new class of antitumor compounds, but there are still some controversial discussions about theire precise mechanism of action. In this study, we show that HePC induce cell death in mock- and Bcl-2-transfected HaCaT-keratincytes and A375 melanoma cells, respectivley. The cell morphology of HePC treated cells had as well apoptotic as necrotic features. Also the intracellular apoptotic machinery was investigated. In both HaCaT cell lines cytochrome C release, caspase-3 activation and DNA fragmentation was detectable. Inhibition by the pancaspase inhibitor zVAD and specific caspase-3, and caspase-9 inhibitors did reduce DNA-fragmentation to control levels in mock transfected HaCaT and HaCaT/Bcl-2 cells, but cell death could be still observed. Inhibition of caspase-8 showed a dual role. In mock transfected HaCaT cells, DNA fragmentation was reduced again to control levels in HaCaT/Bcl-2 cells the fragmentation rate was only slightly reduced. In both cell lines, there was no dependency to de novo ceramide formation as a mediator for DNA fragmentation. In brief, we described a complex scenario of HePC-induced cell death morphology and its mechanisms of induction.