Proteomische und biophysikalische Analyse GYF-Domänen-vermittelter Interaktionen

Abstract

GYF-Domänen bezeichnen eine kleine Familie von Protein-Interaktionsdomänen, die prolinreiche Sequenzen (PRS) binden und über die Erkennung dieser mit anderen Proteinen interagieren. Benannt sind sie nach dem konservierten Motiv aus Glycin, Tyrosin und Phenylalanin (GYF) innerhalb der Domäne, das direkt an der Bindung des Liganden beteiligt ist. Aus dem Sequenzvergleich verschiedener GYF-Domänen wurden zwei Unterfamilien, die der CD2BP2- und Smy2-ähnlichen GYF- Domänen, definiert. Neben Sequenz- und Strukturunterschieden der Unterfamilien, sind sie auch in Proteinen unterschiedlicher Zellkompartimente enthalten. Während Proteine mit einer Domäne vom CD2BP2-Typ mit dem Spleißprozess im Zellkern assoziiert sind, weisen Proteine mit einer GYF- Domäne vom Smy2-Typ eine zytoplasmatische Lokalisation auf. Es gibt bereits erste Hinweise auf Interaktionspartner der GYF-Domänen, jedoch ist die biologische Funktion von GYF-Proteinen noch weitgehend unbekannt. In dieser Arbeit wurde das direkte Interaktom der GYF-Domänen der humanen Proteine CD2BP2 und GIGYF2, sowie des Hefeproteins Smy2 mit dem Ziel untersucht, weitere Hinweise auf ihre Funktion zu erhalten. Hierzu wurden die isolierten GYF-Domänen in Pulldown-Experimenten eingesetzt und ihre Bindungspartner über Massenspektrometrie (MS) bestimmt. Durch Ausnutzung der quantitativen MS konnte eine spezifische Identifizierung des Interaktoms der jeweiligen PRS- Bindungsstellen durchgeführt werden. Für GIGYF2 und Smy2 war dies die erste Charakterisierung PRS-vermittelter Bindungspartner. Für CD2BP2 wurden bereits bestehende Interaktomdaten in einem organspezifischen Kontext neu untersucht. Da eine Vielzahl essentieller, intrazellulärer Prozesse auf der Erkennung prolinreicher Sequenzen durch PRS-Bindungsdomänen (PRDs) beruht, ist diese Interaktion auch von therapeutischem Interesse. Daher wurden im zweiten Teil dieser Arbeit zwei Strategien zur spezifischen Inhibition dieser Proteininteraktion betrachtet. Die Validierung der Inhibitionsmethoden, entweder durch ein Peptidmimetikum oder durch ein Kleinmolekül, erfolgte durch NMR-spektroskopische Bindungsstudien. In dieser weitreichenden Untersuchung direkter Bindungspartner der GYF-Domänen konnten neue, noch unbekannte Interaktionen ermittelt werden. Insbesondere die Daten für GIGYF2 und Smy2, Proteine, die sich durch eine zytoplasmatische Lokalisation und eine GYF- Domäne vom Smy2-Typ auszeichnen, lieferten Hinweise auf eine konservierte Funktion. Beide Proteine können im Kontext bereits beschriebener Funktionen und mittels der Ergebnisse dieser Arbeit in Verbindung mit mRNA- prozessierenden Proteinen und der vesikulären Transportmaschinerie gebracht werden. Für CD2BP2 legt die deutliche Expression in hämatopoetischen Organen adulter Mäuse eine potentielle Funktion im Immunsystem nahe. Auch wenn keine neuen, direkten Bindungspartner ermittelt wurden, untermauern die Ergebnisse die Assoziation mit spleißosomalen Komplexen. Darüber hinaus ist eine Funktion in Kombination mit weiteren mRNA-prozessierenden Proteinen im Zellkern möglich. Während die Suche nach einem Kleinmolekül keine geeigneten Inhibitoren hervorbrachte, ergaben sich aus der Untersuchung des Peptidmimetikums erste Hinweise auf mögliche Ansatzpunkte zur Inhibition der PRS/PRD-Interaktion. Obwohl das Peptidmimetikum kein hoch affiner Ligand der GYF-Domäne war, ist es als Ausgangspunkt für weitere Optimierungsschritte nützlich. Zusammenfassend tragen die Ergebnisse dieser Arbeit zum tieferen Verständnis von GYF-Domänen und deren Beteiligung an zellulären Prozessen teil.

GYF domains belong to a small class of protein adapter domains, which recognize proline-rich sequences (PRS) within their binding partners. They are named after a conserved motif consisting of glycine, tyrosine and phenylalanine (GYF) in the domain that is directly involved in ligand binding. GYF domains are divided into two subfamilies: the CD2BP2- and Smy2-like GYF domains which differ in sequence and structure. In addition to these differences, proteins containing either of these domains are found in different cellular compartments. While proteins containing a CD2BP2-type GYF domain are associated with splicing in the nucleus, proteins with a Smy2-type domain show cytoplasmic localization. The biological role of GYF proteins is still largely unknown, although there are few described interaction partners. The aim of this work was to selectively detect proteins and protein complexes bound via proline-rich sequences to the GYF domains of the human proteins CD2BP2 and GIGYF2, as well as the yeast protein Smy2 to gain further information about their function. For this reason, the isolated GYF domains were used in pull-down experiments in combination with quantitative mass spectrometry (MS). This was the first characterization of PRS-mediated binding partners for GIGYF2 and Smy2. For CD2BP2 this study was performed in an organ specific analysis of interaction partners as extension of previous studies. As a variety of essential, intracellular processes is based on the recognition of proline-rich sequences by PRS-binding domains (PRDs), this interaction is also of therapeutic interest. Therefore, in the second part of this work, two strategies for specific inhibition of this protein interaction (by either a peptide mimetic or a small molecule) were validated by NMR spectroscopic binding studies. In this study new binding partner of the GYF domains were determined. In particular, for GIGYF2 and Smy2, that are characterized by a cytoplasmic localization and a Smy2-type GYF domain, this study provided information for a conserved function. Together with previously described functions the results of this work links both proteins to mRNA-processing proteins and the vesicular transport. The distinct expression of CD2BP2 in hematopoietic organs in adult mice refers to a potential role of CD2BP2 in the immune system. Even if no new direct binding partner has been identified, the results support the association with spliceosomal complexes. In addition, it is tempting to speculate about a function of CD2BP2 with other mRNA-processing proteins in the nucleus. The small molecule approach did not result in the identification of specific PRS/PRD-inhibitors. Although the peptidomimetic was not a high affinity ligand for the GYF domain, it will be useful for further optimization steps. In summary, the results of this study contribute in part to a deeper understanding of GYF domains and their involvement in cellular processes.