Vergleichende Untersuchungen zur Proliferationshemmung ausgewählter Tumorzelllinien durch Fluorouracil-Essigsäure in verschiedenen Darreichungsformen

Abstract

Einleitung: 5 Fluorouracil (5 FU) ist ein Zytostatikum, das in der Klinik z.B. für die Therapie des Mamma- bzw. des kolorektalen Karzinoms eingesetzt wird. Die Nebenwirkungen, die es bei Patienten verursacht (z.B. Hand-Fuß-Syndrom, etc.), und lange Applikationszeiten, die aufgrund einer kurzen Plasma-t1/2 notwendig sind, bedeuten allerdings erhebliche Nachteile. Die genannten Schwächen der Therapie mit 5 FU könnten vermutlich mit Hilfe eines passenden Carriers behoben werden. Albumin bietet sich als Transportmolekül an, weil es über eine lange Plasma t1/2 von ungefähr 19 Tagen verfügt und darüber hinaus gezeigt wurde, dass Tumorzellen Albumin endozytieren und im Intrazellulärraum durch lysosomale Enzyme abbauen. Methodik: Zunächst wurde 5 FU modifiziert, indem am N1-Atom des Uracil-Ringes eine Me-thyl-Carboxyl-Gruppe gebunden wurde. Das Reaktionsprodukt (FUAc) wurde im nächsten Schritt mit Hilfe der Carbodiimid-Methode kovalent an die Modellsubstanz BSA gekoppelt, so-dass FUAc-BSA entstand. Der Syntheseerfolg wurde mittels 1H-, 13C- und 19F-NMR- Spektroskopie sowie MALDI-ToF untersucht. MTT-Tests, Zellzählungstests und CLSM-Studien wurden mit Tumorzellen der Zelllinien MDA MB 231 und T 47D durchgeführt, um das zytosta-tische Potential und die zelluläre Aufnahme von FUAc-BSA einzuschätzen. Ergebnisse: Die molare Masse von FUAc-BSA (68.508 Da) war im Vergleich zu BSA (66.306 Da) um ca. 2.200 Da gesteigert, was einer Kopplung von durchschnittlich 12 Molekülen FUAc je BSA-Molekül entspricht. Sowohl die Resultate des MTT-Tests als auch des Zellzäh-lungstests lassen erkennen, dass die Proliferationshemmung bei mABP-exprimierenden Zellen (T 47D) durch FUAc-BSA der durch 5 FU ähnelt. Für Zellen der Linie MDA-MB 231 (keine mABP-Expression) ist ein schwächerer zytostatischer Einfluss feststellbar. Die Resultate deuten an, dass mABP eine wichtige Rolle für die Wirkung albuminbasierter Zytostatika spielen könnte. Für FUAc war im MTT-Test bei beiden Zelllinien eine Überbestimmung der Zellvitalität gegen-über dem Zellzählungstest feststellbar. Diese Beobachtung kann unter der Annahme einer intra-zellulären Spaltung von FUAc in 5 FU und Acetat, mit der anschließenden Aktivierung des Ci-tratzyklus, begründet werden. Schlussfolgerung: FUAc-BSA würde im klinischen Einsatz voraussichtlich gewisse Vorteile gegenüber 5 FU aufweisen, wie eine längere Plasma-t1/2 und eine spezifische Aufnahme durch Tumorzellen bei vergleichbarer Wirksamkeit. Eine Untersuchung auf die Expression von mABP könnte ausschlaggebend für eine wirksame Behandlung mit albuminbasierten Zytostatika sein.

Introduction: 5-Fluorouracil (5-FU) is a clinically well-established anti- cancer drug used for the treatment of many cancer types, such as breast and colorectal cancer. However, adverse effects (e.g. myelosuppression) and long administration periods due to its short blood plasma half-life (plasma-t1/2) are substantial disadvantages of its application. By coupling 5-FU or a 5 FU adduct to a carrier-molecule it might be possible to overcome these disadvantages. A favorable drug-carrier characteristic is a long intravascular circulation time and additionally a high affinity of tumor cells to the carrier. Albumin meets those requirements, as it has a plasma-t1/2 of approxi- mately 19 days. Moreover, tumor cells endocytose albumin and degrade the protein in the intra-cellular space by lysosomal proteolysis. Methods: First 5-FU was modified by coupling an acetic acid at its N1-ring atom, the resulting adduct (FUAc) was bound covalently to a carrier molecule (bovine serum albumin, BSA (as model substance)) via carbodiimide coupling, and FUAc- BSA was obtained. The synthesis suc-cess was confirmed by 1H-, 13C- and 19F- NMR-spectrometry as well as MALDI-ToF. MTT-assays and cell counting assays as well as CLSM studies with breast cancer cell lines T 47D and MDA MB 231 were performed to evaluate the cytostatic potential and uptake of FUAc-BSA. Results: The molar mass of FUAc-BSA (68,508 Da) was increased by about 2,200 Da compared to pure BSA (66,306 Da), which corresponds to the binding of 12 molecules FUAc per BSA molecule. The MTT-results as well as cell counting results demonstrate that the proliferation inhibition of membrane albumin- binding protein (mABP)-expressing T 47D cells by FUAc-BSA is similar to that of 5-FU and only moderate for MDA MB 231 cells that lack such expression. That indicates that mABP might play an important role for albumin-based drug delivery. When adding FUAc an overestimation of cell vitality in MTT-assays compared to cell counting was found in both cell lines, which could be explained assuming an intracellular conversion from FUAc to 5 FU and acetate combined with resulting activation of the citric-acid cycle. Conclusion: FUAc- BSA might probably have many clinical advantages in comparison to 5-FU, such as reduced adverse effects due to specific uptake by tumor cells, a prolonged plasma-t1/2 and similar effectiveness. Further evaluation is necessary, but testing the tumorous expression of mABP could be crucial for successful treatment of patients with albumin-coupled drugs.