Intestinaler H2-Metabolismus: In vitro-Experimente und Etablierung eines gnotobiotischen Rattenmodells

Abstract

1) Aus humanen Faeces wurden 94 Organismen, die am intestinalen H2-Metabolismus beteiligt sind, isoliert und charakterisiert. Als H2-Produzenten wurden bekannte Arten der Gattungen Bacteroides, Clostridium, Enterococcus, Escherichia, Eubacterium und Klebsiella sowie zwei Bakterienstämme einer bislang unbekannten Art identifiziert. Außerdem wurde als Vertreter der H2-oxidierenden Darmflora eine Art der Gattung Methanobrevibacter isoliert. 2) Anhand ihrer phänotypischen und genotypischen Charakteristika wird vorgeschlagen, für die beiden unbekannten Stämme die neu zu schaffende Gattung Dorea gen. nov. mit der Art Dorea longicatena sp. nov. zu schaffen. Mittels einer gegen die 16S rRNA gerichteten Oligonukleotidsonde wurde D. longicatena sp. nov. in Faeces aller untersuchten Individuen nachgewiesen. Die Zellzahlen betrugen durchschnittlich 1,55 x 10 hoch 9 Zellen/g Trockenmasse und stellten mit durchschnittlich 0,58% einen z. T. bedeutenden Anteil an der Gesamtflora dar. 3) In Faecesinkubationen wurde in Verdünnungen von 10-7 am meisten H2 gebildet. Aus dieser Verdünnungsstufe wurden mit Clostridium perfringens, Escherichia coli und Klebsiella pneumoniae auch diejenigen Bakterien isoliert, die in in vitro-Untersuchungen aller Isolate neben Eubacterium hadrum die stärkste H2-Bildung (> 6 µmol H2/ml Medium) aufwiesen. Dabei war E. hadrum die einzige Spezies, die in Faeces in Zellzahlen > 10 hoch 9/g Faecestrockenmasse vorkam und mehr als 8 µmol H2/ml Medium produzierte. Bacteroides spp. und Bifidobacterium spp. kamen zwar in höheren Zellzahlen vor, bildeten aber sehr wenig H2 (< 2 µmol/ml Medium). 4) Durch Fermentationsversuche wurde die H2-Bildung durch C. perfringens, E. coli und E. hadrum eingehend untersucht. In weiteren in vitro-Experimenten mit definierten Kokulturen aus H2-produzierenden und H2-oxidierenden Bakterien wurde die Übertragung von H2 zwischen den verschiedenen Spezies sowie die damit einhergehende Beeinflussung ihrer Fermentationsbilanzen demonstriert. Gleichzeitig wurde die Rolle von Formiat für den H2-Transfer zwischen dem acetogenen Clostridium coccoides und H2-produzierenden Spezies wie C. perfringens bzw. D. longicatena sp. nov. verdeutlicht. Weiterhin wurde in vitro gezeigt, daß E. coli in Kokulturen den für das Wachstum und die CH4-Produktion von Methanobrevibacter RT-1 benötigten Wasserstoff zur Verfügung stellen kann. 5) Für die in vivo-Untersuchung des intestinalen H2-Metabolismus wurde ein neu entwickeltes gnotobiotisches Rattenmodell eingesetzt und durch mehrere Experimente als zuverlässig und genau arbeitendes System etabliert. Mit diesem Modell konnte die H2-Ausscheidung gnotobiotischer Ratten erstmals über 24 h gemessen und gleichzeitig der definierte mikrobiologische Status dieser Ratten aufrechterhalten werden. Die von monoassoziierten Tieren ausgeschiedene H2-Menge war von der verabreichten Testsubstanz, der Diät und den im Intestinaltrakt angesiedelten Mikroorganismen abhängig. So wurde von Ratten, die mit C. perfringens monoassoziiert worden waren, abhängig von der Menge der Testsubstanz immer mehr H2 ausgeschieden als durch Ratten, die mit E. coli monoassoziiert worden waren. Auch die Verwendung von einem Ratten-standardfutter resultierte in einer höheren H2-Bildung als der Einsatz einer chemisch definierten Diät. 6) Ratten, die mit H2-produzierenden Bakterien (C. perfringens oder E. coli) und H2-nutzenden Bakterien (Acetogene, Methanogene oder Sulfatreduzenten) diassoziiert worden waren, schieden immer weniger H2 aus als Ratten, die mit H2-Produzenten monoassoziiert worden waren. Bei Ratten, die mit C. perfringens und dem acetogenen C. coccoides diassoziiert worden waren, war diese Verminderung allerdings nicht auf reduktive Acetogenese sondern auf die Fähigkeit von C. coccoides zu mixotrophem Wachstum zurückzuführen. 7) Drei von sieben Ratten, die mit E. coli und Methanobrevibacter RT-1 diassoziiert worden waren, schieden Methan aus, was auf einen H2-Transfer zwischen diesen beiden Bakterienspezies hinweist. 8) Auch bei Ratten, die mit E. coli und Desulfovibrio sp. (DSM 7057) diassoziiert worden waren, verminderte sich die H2-Ausscheidung im Vergleich zu mono-assoziierten Tieren. Diese Verminderung war geringer als bei Ratten, die mit Methanobrevibacter RT-1 assoziiert worden waren, und war unabhängig von der Sulfatkonzentration im Trinkwasser der Tiere oder der zu Beginn der Meßperiode verabreichten Sulfatmenge. In Faecesinkubationen dieser Tiere wurde eine H2-Übertragung von E. coli zu Desulfovibrio sp. (DSM 7057) sowie eine stöchiometrische Sulfidbildung nachgewiesen. 9) Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, daß das verwendete gnotobiotische Ratten-modell in Kombination mit entsprechenden Untersuchungen in vitro geeignet ist, den intestinalen H2-Metabolismus zu studieren.

1) Ninety four microorganisms participating in intestinal hydrogen metabolism were isolated from human faeces and were characterised. Several known species of the genera Bacteroides, Clostridium, Enterococcus, Escherichia, Eubacterium and Klebsiella as well as two hitherto unknown strains were identified as hydrogen producing bacteria. One isolate representing the hydrogen oxidising gut flora was identified as a species of the genus Methanobrevibacter. 2) Based on phenotypic and phylogenetic considerations it is proposed that the two unknown strains be classified in a new genus Dorea as Dorea longicatena sp. nov.. Experiments with a specific 16S rRNA directed oligonucleotide indicate that D. longicatena sp. nov. is present in all human volunteers studied so far at average cell counts of 1,55 x 10 to the power of 9 per gram of dry weight faeces. They form with 0,58% of the total cell count a considerable proportion of the total flora. 3) In incubations of faeces hydrogen production was highest in dilutions of 10-7. Clostridium perfringens, Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae were isolated from equally diluted faeces and exhibited the strongest hydrogen production (> 6 µmol H2/ml medium) of all isolates studied. Eubacterium hadrum was the only species which was found in cell counts of > 10 to the power of 9 per gram dry weight of faeces and which produced more than 8 µmol H2/ ml medium. Higher cell counts were detected for Bacteroides spp. and Bifidobacterium spp., respectively, but they produced only < 2 µmol H2/ml medium. 4) The hydrogen production of C. perfringens, E. coli and E. hadrum was investigated in fermentation experiments in more detail. The transfer of hydrogen between hydrogen producing and hydrogen oxidising bacteria and the following shift in fermentation balance was demonstrated in further in vitro experiments with defined cocultures. Simultaneously, the role of formate in hydrogen transfer between the acetogenic Clostridium coccoides and hydrogen producing bacteria such as C. perfringens and D. longicatena sp. nov., respectively, is described. Furthermore, it was shown in vitro that the hydrogen production through E. coli enabled Methanobrevibacter RT-1 to grow and to produce methane in coculture. 5) A newly developed rat model was used to study the intestinal hydrogen metabolism in vivo and was established as a reliable and accurate working system through a series of experiments. This model opened for the first time the possibility to quantify the hydrogen excretion of gnotobiotic rats over a period of 24 h and maintain at the same time their defined microbiological status. The amount of hydrogen excreted by the monoassociated rats depended on the test substance, the diet and the species used for colonisation. Rats associated with C. perfringens excreted always more hydrogen than rats associated with E. coli when the same amount of test substance was fed. Similarly, the standard rat diet resulted in more hydrogen formation than the chemically defined diet. 6) Rats associated simultaneously with a hydrogen producing bacterial species (C. perfringens or E. coli) and a hydrogen utilising species (acetogenic, methanogenic or sulphate reducing bacteria) excreted less hydrogen than rats associated with the hydrogen producing bacteria only. In rats associated simultaneously with C. perfringens and the acetogenic C. coccoides, this decrease was not the result of reductive acetogenesis but due C. coccoides? ability to grow mixotrophically. 7) Rats associated simultaneously with E. coli and Methanobrevibacter RT-1 formed methane indicating hydrogen transfer between the two species, although methane excretion was observed in only three out of seven animals. 8) Rats associated simultaneously with E. coli and Desulfovibrio sp. (DSM 7057) excreted also less hydrogen than monoassociated rats. This decrease was smaller than the one of the rats associated with Methanobrevibacter RT-1. The hydrogen excretion was independent of the concentration of sulphate in drinking water or the amount of sulphate administered at the beginning of each experimental period. Hydrogen transfer between E. coli and Desulfovibrio sp. (DSM 7057) and a stoichiometric sulphide production was demonstrated in incubations of faeces from these animals. 9) The results of these experiments show that the used gnotobiotic rat model in combination with appropriate investigations in vitro is useful to study the intestinal hydrogen metabolism