Determinanten des Zelltropismus humaner und simianer Immundefizienzviren und Charakterisierung wesentlicher Eigenschaften physiologischer Liganden der HIV- Rezeptoren

Abstract

In den vorliegenden Arbeiten werden unterschiedliche Aspekte des Zelltropismus von HIV und SIV untersucht. Im Fokus stehen dabei insbesondere die viralen Rezeptoren und einige ihrer physiologischen Bindungspartner. Der HIV- und SIV- Tropismus ist überwiegend über die Expression von CD4 und Korezeptor definiert. Eine Ausnahme sind Makrophagen von Rhesusaffen. Trotz der Expression von CD4 und CCR5 replizieren nur M-trope und nicht T-trope SIVmac- Isolate in diesen Zellen. Als Determinante des SIVmac-Tropismus ist die geringe CD4-Expression ihrer Makrophagen ermittelt worden. Die Fähigkeit M-troper SIVmac-Stämme, mit der geringen CD4-Expression der Makrophagen eine hohe Infektionsrate zu erreichen, geht mit einer teilweisen CD4-Unabhängigkeit einher. In einer weiteren Tropismusstudie wurde die Infektion von unreifen Mastzellen (PrMC) untersucht. Im Unterschied zu reifen Mastzellen (MC) exprimieren PrMC sowohl CD4 als auch CCR5, CXCR4 und CCR3. Nach Infektion im PrMC-Stadium differenzieren die Zellen zu reifen MCs und stellen ein potentielles HIV-Reservoir dar. Die hohe Expression, native Isolierung und Rekonstitution des CCR5-Korezeptors stand im Fokus biochemischer Untersuchungen. Eine Solubilisierung des Membranproteins im gefalteten nativen Zustand wurde mit Cyclohexyl-Pentyl-beta-D-Maltosid erreicht. Einem Hinweis auf eine Rolle posttranskriptionaler Modifikationen des CCR5-Proteins bei der Bindung von Liganden wurde in einer weiteren Arbeit nachgegangen. Hierbei konnte gezeigt werden, dass CCR5 an Serin 6 ein O-Glykan enthält. Die O-Glykosylierung spielt keinerlei Rolle beim CCR5-vermittelten Eintritt von HIV in die Zelle. Im Gegensatz dazu sind die Zucker und insbesondere die endständigen Sialinsäuren mit ihren negativen Ladungen für die Interaktion mit den beta-Chemokinliganden essentiell. Neben den CCR5-Liganden können auch Bindungspartner des CD4-Rezeptors die HIV-Replikation modulieren. Bestimmte CD4-spezifische Antikörper als auch der physiologische Ligand Interleukin-16 (IL-16) sind in der Lage, über eine Signaltransduktionskette die LTR-Aktivität zu hemmen. Aus diesem Grunde wurden das IL-16-Gen und sein Promotor analysiert. Das in Lymphozyten exprimierte IL-16 wird in Form eines 67 kDa großen Vorläuferproteins (Pro-IL-16) synthetisiert. Nach Spaltung durch die Caspase 3 wird dessen C-terminales Fragment von 13 kDa als reifes antiretrovirales Zytokin sezerniert. Das Pro-IL-16-kodierende Gen besteht aus sieben Exons und besitzt einen Promotor ohne TATA-Box. Die Expression ist wesentlich durch GA-Binding Proteins (GABPs) gesteuert, die auch im IL-2-Enhancer die Induktion der Transkription regulieren. Der intrazelluläre Transport des Pro-IL-16 erfolgt über Aktomyosin-Komplexe. Als Bindungspartner des Vorläuferproteins wurden mit MYPT1, MYPT2 und MBS85 drei nahe verwandte regulatorische Untereinheiten der Myosin-Poshosphatase mit Hilfe des Yeast Two-Hybrid-Systems identifiziert. Ihr C-Terminus bindet an die PDZ2-Domäne des Pro-IL-16. Aufgrund der gefundenen Interaktionspartner des Pro-IL-16 bleibt festzuhalten, dass neben seiner Rolle als Vorläuferprotein eines antiretroviralen Zytokins noch weitere physiologische Funktionen wahrscheinlich sind.

The work presented here addresses various aspects of HIV and SIV cell tropism, focussing on the viral receptors and a number of their ligands. The cellular tropism of HIV and SIV is predominantly defined by the expression of CD4 and a coreceptor, with one exception being macrophages from rhesus macaques. Despite expression of CD4 and CCR5, only M-tropic but not T-tropic strains are able to infect these cells. The low expression of CD4 on rhesus macrophages has been identified as the main determinant of SIVmac tropism and the ability of M-tropic strains to infect the macrophages of these primates is linked to a partial CD4 independence with regards to infection. In a further tropism study, HIV-1 infection of precursor mast cells (PrMC) was investigated. In contrast to mature mast cells (MC), PrMC express CD4, CCR5, CXCR4 and CCR3. Following infection in the PrMC state, the cells differentiate into MC and represent a potential reservoir for HIV. High expression, native isolation and reconstitution of the CCR5 coreceptor were the topic of a biochemical study in which solubilisation in the native, folded state was achieved using cyclohexyl-pentyl-beta-D-maltoside. The role of posttranscriptional modification of the CCR5 protein for binding of ligands was also investigated. It could be demonstrated that serine 6 is O-glycosylated and that the glycan, while not effecting HIV-1 entry, influences chemokine binding. In particular, the negatively charged terminal sialic acids are crucial for high affinity interactions. In addition to the various CCR5 ligands, interaction partners of the CD4 receptor can also modulate HIV-1 replication. Some CD4-specific antibodies and the physiologic ligand interleukin-16 (IL-16) are able to inhibit the LTR-promoter by a signal transduction cascade. The IL-16 gene and its promoter were therefore analysed in detail. In lymphocytes, the IL-16 cytokine is synthesised in the form of a large 67 kDa precursor protein, pro- IL-16. Following cleavage by caspase 3, a C-terminal fragment representing the mature IL-16 is released. The pro-IL-16 coding gene consists of 7 exons and a TATA-Box-less promoter. Expression is mainly regulated by GA-binding proteins (GABP) which also drive the expression from the IL-2 enhancer element. The intracellular transport of pro-IL-16 is actomyosine-dependent. Three closely related myosine phospatase regulatory subunits MYPT1, MYPT2 and MBS85 have been identified using yeast two-hybrid assays as binding partners of pro- IL-16. The C-terminus of these subunits interacts with the PDZ2 domain of the precursor protein. It is therefore likely that in addition to its role as the precursor protein of a cytokine, pro-IL-16 may have additional physiological functions.