Makromolekulare Kristallographie bei atomarer Auflösung:Synthetische Nukleinsäurefragmente und bakterielle Kälteschockproteine

Abstract

Kristallstrukturanalyse von ALAwt und ALAC70 Die Haupterkennungssignale für die spezifische Erkennung der tRNAAla aus E. coli durch die AlaRS sind im Akzeptorstamm dieses Moleküls lokalisiert. Ein über alle Lebensformen konserviertes G3*U70-Basenpaar stellt hierbei das Haupterkennungselement dar. Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführte Strukturanalyse des heptameren Akzeptorstamms ALAwt und der inaktiven C70-Mutante, ALAC70, sollte Hinweise über die strukturelle Basis dieser Erkennungsmechanismen von der Seite der RNA geben. Daneben sollte diese Studie einen Einblick in das strukturelle Verhalten und die Auswirkungen eines G*U "wobble"-Basenpaars innerhalb eines Watson-Crick -gepaarten Doppelstrangs geben.

Kristallstrukturanalyse eines 3´-DNA-RNA-5´ Hybrids aus HIV-I Das chimäre Oktamer HIVChi dient als Modell für die Beschreibung der 3´-DNA- RNA-5´ Verknüpfung, welches bei der Initiation der Minus-Strang-Synthese der HIV-Replikation gebildet wird. HIVChi kristallisiert mit zwei identischen Oktamerduplexen in der asymmetrischen Einheit. Beide Moleküle liegen in der A-Konformation vor. Dies beinhaltet eine C3´-endo Zuckerwellung für alle 32 Ribosen bzw. Desoxyribosen. Der Vergleich der tetrameren RNA-RNA- sowie RNA- DNA-Duplexhälften, sowie die Analyse des Übergangsbereichs ergab keine signifikanten Unterschiede, die durch die Basenpaarung von RNA mit DNA- Nukleotiden erklärt werden könnte. Die sequenzabhängige Analyse der Helixparameter ergab eine geringe Korrelation beim Vergleich der beiden Kopien.

Kristallstrukturanalyse von Bc-Csp und der Bc-CspR3E-Mutante Die Kristallstrukturen des Kälteschockproteins Bc-Csp aus Bacillus caldolyticus und seiner R3E-Mutante konnten bei atomarer Auflösung mit einer großen Genauigkeit bestimmt werden. Beide Proteine kristallisieren isomorph in der tetragonalen Raumgruppe I41 mit zwei Proteinmolekülen in der asymmetrischen Einheit. Diese bilden Homodimere aus, deren Struktur sich von der Dimerstruktur des Kälteschockproteins CspB aus Bacillus subtilis unterscheidet. Die dreidimensionale Struktur des Bc-Csp Monomers entspricht nahezu der von CspB. Es konnten lediglich geringfügige Abweichungen des Hauptkettenverlaufs innerhalb flexibler Schleifenbereiche identifiziert werden. Diese Abweichungen konnten teilweise bezüglich einer erhöhten Stabilität der Polypeptidkette durch zusätzliche Wechselwirkungen bei Bc-Csp interpretiert werden. Die spezifische Bindung eines Na+-Kations im Bereich von Schleife 2 stabilisiert die beta-Faltblattstruktur zwischen Strang beta2-beta3. Von besonderem Interesse ist die Analyse des Bereichs der E3R- und A46E-Mutationen beim Übergang vom mesophilen zum thermophilen Protein. Bc- Csp ist in der Lage, eine stabilisierende Salzbrücke zwischen R3 und E46 unter zusätzlicher Stabilisierung durch den Rest K5 auszubilden. Der Verlust der solvenzexponierten R3-E46 Salzbrücke kann den Verlust an Thermostabilität alleine nicht erklären.

Crystal Structure of ALAwt and ALAC70 The acceptor stem of tRNAAla from E. coli contains the main identity element for specific aminoacylation by it´s cognate alanyl-tRNA-Synthetase (AlaRS). It is known, that the presence of the G3*U70 wobble base pair, which is fully conserved within all kingdoms of life, is essential for this process. The major goal of this work was the structure analysis of the heptameric microhelix ALAwt as well as of the inactive mutant ALAC70, in order to gain insight into the structural basis of recognition. Additionally, this work was aimed to provide information about the behavior of a single G*U wobble base pair within a Watson-Crick double helix.

Crystal Structure of a 3´-DNA-RNA-5´ Hybrid from HIV-1 During initiation of minus-strand synthesis by HIV-1 reverse transcriptase a 3 ´-DNA-RNA-5´ junction is formed involving the 3´-end of tRNAlys,3. The HIV-RT- associated RNase H cleaves the. RNA template strand specifically, opposite the newly synthesized DNA strand. The crystal structure at 1.9 Å resolution of an eight-base pair hybrid duplex representing the junction has been performed to identify global or local structural perturbations which may be recognized by HIV-RT RNase H. In the crystal HIVChi is present as two independent copies in the asymmetric unit. Both junction octamers adopt A-type conformation throughout their entire length. This is clearly apparent from the C3´-endo sugar pucker present in all 32 nucleotides and from the average helical parameters.

Crystal Structure of Bc-Csp and the Bc-CspR3E mutant The crystal structure of the cold-shock protein Bc-Csp and it´s R3E-mutant was refined close to atomic resolution. Both proteins crystallize isomorphously in the tetragonal space group I41 with two molecules present in the asymmetric unit. These dimers are different from the CspB dimer. The three dimensional structures of Bc-Csp monomer in comparison with CspB are highly identical. There are only some slight variations of main chain geometry within flexible loop regions. These differences are further discussed in terms of an increased thermostability of the Bc-Csp protein. One region of special interest is the site of the R3E and E46A mutation converting two residues of the sequence of the mesophilic CspB to the thermophilic Bc-Csp protein sequence. Bc-Csp has the ability of forming a salt bridge between R3 and E46 and involving interactions with the side chain of residue K5. However the Bc-CspR3E mutant is 6 kJ/mol less stable than wildtype Bc-Csp. destabilization when compared to wildtype Bc-Csp.