Untersuchungen zur Funktion der cGMP-abhängigen Kinase I alpha während der Entwicklung des Nervensystems

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurden folgende Punkte untersucht, um mehr über die Funktion der cGKIa im Nervensystem und insbesondere beim axonalen Wachstum sensorischer Neurone zu erfahren:

a) Die Expression der cGKIa im embryonalen und frühen postnatalen Nervensystem der Maus wurde mit Hilfe eines isoformspezifischen Antikörpers in Ganzkörperfärbungen, Gewebeschnitten und Gewebe-Lysaten charakterisiert. Das beobachtete zeitliche und räumliche Expressionsmuster der cGKIa spricht für eine mögliche Rolle dieser Kinase beim axonalen Auswachsen, der Migration oder Differenzierung verschiedener Neurone.

b) Einige Zellen, die im Wildtyp eine Expression der cGKIa aufwiesen, wurden in cGKI-defizienten Mäusen hinsichtlich möglicher axonaler Wegfindungs- oder Migrationsfehler untersucht. Hierzu wurden immunhistochemische Untersuchungen mit verschiedenen Antikörpern und Silber/Nissl-Färbungen durchgeführt. Entgegen den Erwartungen konnten im Vergleich zum Wildtyp in keiner der untersuchten Strukturen Wegfindungsfehler oder andere morphologische Unterschiede mit den verwendeten Methoden detektiert werden.

c) Nach Aktivierung durch cGMP phosphoryliert die cGKI verschiedene intrazelluläre Proteine, von denen hier jene untersucht wurden, die mit dem Aktinzytoskelett assoziiert sind (VASP, CRP2, Myosinphosphatase/Myosin IIB). Dabei konnte VASP anhand vergleichender Phosphorylierungsstudien an isolierten cGKI-defizienten- und Wildtyp-Spinalganglien eindeutig als Substrat der cGKI in sensorischen Neuronen identifiziert werden. Weiterhin wurden die entsprechenden KO-Mäuse in verschiedenen Embryonalstadien immunhistochemisch, mit Hilfe verschiedener Antikörper, bezüglich der in der cGKI-Maus gefundenen Wegfindungsfehler sensorischer Spinalganglienaxone untersucht. Es konnten weder in CRP2-, Myosin IIB- noch VASP-defizienten Embryonen Wegfindungsfehler der sensorischen Spinalganglienaxone detektiert werden.

d Weiterhin wurden alternative Ansätze verfolgt, um Substrate und potentielle Interaktionspartner der cGKI bzw. cGKIa im Nervensystem zu finden, die möglicherweise auch in den Spinalganglien eine Rolle spielen könnten. Zum einen wurde mit Hilfe der Zweidimensionalen Gelelektrophorese cGKI- defizientes- und Wildtyp-Cerebellum-Gewebe, nach Stimulation mit dem cGKI- Aktivator 8-pCPT-cGMP, hinsichtlich des Proteinexpressions- und Phosphorylierungsmusters verglichen, um Hinweise auf mögliche Substrate der cGKI zu erhalten. In den durchgeführten vergleichenden Untersuchungen zum Proteinexpressionsmuster konnten sowohl herunter- als auch hochregulierte Proteine im cGKI-defizienten Gewebe entdeckt werden, deren Identität durch Massenspektrometrie geklärt werden konnte. Auch wurden einige Unterschiede im Phosphorylierungsmuster zwischen WT und cGKI-KO festgestellt; die Identifizierung der Proteine war jedoch aufgrund methodischer Schwierigkeiten bislang nicht möglich. In einem zweiten Ansatz wurde zur Identifizierung intrazellulärer Bindungspartner der cGKIa eine cDNA-Bibliothek von Mäusen des Embryonalstadiums E17 mit Hilfe des Zweihybriden Hefesystems durchmustert. Mit der DNA-Methyltransferase 3a (Dnmt3a) und der Hydroxysteroidsulfotransferase 2b1b (Sult2b1b) konnten zwei potentielle Interaktionspartner der cGKIa im Zweihybriden Hefesystem gefunden werden. Die Interaktion der cGKIa mit der Dnmt3a1-Isoform wurde im Lauf der Arbeit weiter verfolgt und konnte mittels Immunpräzipitation verifiziert werden.

To broaden our knowledge about the role of cGKIa in the nervous system, especially in sensory neuron axonal growth, this thesis focussed on the following issues:

a) Using an isoform specific antibody the expression of cGKIa was investigated in wholemounts, brain sections, and western blots during embryonic and early postnatal development of the mouse nervous system. The observed spatiotemporal expression pattern of cGKIa suggests a functional role for the kinase in regulating axonal growth, migration, and differentiation of several neuronal populations.

b) Cells known to express cGKIa in the wildtype were analysed for potential pathfinding errors or migration deficits in mice deficient for cGKI. For this purpose immunohistochemical studies employing several antibodies and Silver /Nissl-Stainings were carried out. However, none of the structures examined varied from those of wildtype littermates with respect to pathfinding errors or other malformations.

c) cGMP-activated cGKI phosphorylates several intracellular target proteins. Three of those proteins (VASP, CRP2 and myosin phosphatase/myosin IIB) were chosen for further investigations due to their ability to regulate cytoskelatal dynamics. Phosphorylation studies using isolated dorsal root ganglia (DRGs) from cGKI-deficient and wildtyp mice allowed the clear identification of VASP as a phosphorylation target of cGKI in sensory neurons. Furthermore, using a panel of antibodies several developmental stages of the corresponding knockout mice were immunohistochemically tested for pathfinding errors with respect to those found in the cGKI-knockout mouse. However, in none of these knockout mice pathfinding of DRG axons was disturbed, suggesting that - disregard of potential compensatory effects - none of these proteins is involved in the pathfinding errors, detected in cGKI deficient mice.

d) Assuming that none of the cGKI targets investigated so far is essential for pathfinding of sensory axons, it was necessary to pursuit alternative approaches to identify potential targets and binding partners of cGKI or cGKIa in the nervous system, possibly playing a role in DRGs too. In an approach to find potential substrates of cGKI, tissue lysates from cGKI deficient or wildtype cerebellum after stimulation by the cGKI activator 8-pCPT-cGMP were separated by two-dimensional gelelectrophoresis and compared for differences in the pattern of protein expression or phosphorylation, respectively. Comparative studies of changes in protein expression due to the lack of cGKI revealed both downregulated and upregulated proteins, which were identified by mass spectrometry. Although some differences in the phosphorylaton pattern of wildtype and cGKI-deficient mice were observed also, identification of those proteins requires further investigations due to methodological problems. In a second approach the yeast two-hybrid system was used to screen an E17 mouse library for intracellular interaction partners of cGKIa. Two potential interaction partners for cGKIa have been found: the DNA-methyltransferase 3a (Dnmt3a) and the hydroxysteroid sulfotransferase 2b1b (Sult2b1b). The interaction between cGKIa and isoform 1 of Dnmt3a was independently confirmed by immunoprecipitation studies in COS-7 cells.