Das porzine Jejunumepithel: Optimierung eines Zellkulturmodells und Charakterisierung des Effekts von Zink auf die intestinale Barrierefunktion

Abstract

In der Schweinezucht tritt nach der Entwöhnung von der Muttermilch oft eine infektiologisch verursachte Diarrhösymptomatik auf, die für die Absetzferkel letal sein kann. Im Rahmen eines DFG-Verbundprojekts (SFB 852) mit dem Ziel, die Ferkelüberlebensrate zu steigern, war die Aufgabe der vorliegenden Arbeit, die Untersuchung von Faktoren, die die intestinale Barriere stärken oder wiederherstellen. Ein Großteil der Verbundprojektstudien wurde an dem porzin- jejunalen Zellkulturmodell IPEC-J2 und an nativen Darmepithelien von Ferkeln durchgeführt. Ausgangspunkt des ersten Teils dieser Arbeit war der Befund, dass das bisher allgemein verwendete Zellkulturmodell IPEC-J2, hinsichtlich seiner Barriere- und Transporteigenschaften, dem Dünndarmepithel völlig unähnlich war, wodurch Effekte von Nahrungsfaktoren bisher nicht realistisch analysiert werden konnten. Dieser Teil der Arbeit hatte deshalb zum Ziel, die Zelllinie IPEC-J2 in ein besser geeignetes Modell zu konvertieren und die beiden Zellsysteme hinsichtlich epithelialer Struktur, Elektrophysiologie und Expression von epithelialen Polarisationsmarkerproteinen und barriererelevanten Tight Junction (TJ)-Proteinen zu charakterisieren. Dazu wurden IPEC-J2 auf permeablen Filtermembranen kultiviert – entweder konventionell mit fetal bovine serum (FBS) oder speziesspezifisch mit porcine serum (PS). Mukosae des porzinen Jejunums wurden zum Vergleich analysiert. Elektrophysiologische, morphometrische, ultrastrukturelle und proteinbiochemische Versuche ergaben, dass unter PS-Kultivierung (IPEC-J2/PS), verglichen mit der FBS-Kultur (IPEC-J2/FBS), die Zellhöhe um das 6-fache zunahm, während sich der Zelldurchmesser halbierte. Außerdem wies die apikale Zellmembran von IPEC-J2/PS typische Mikrovilli auf. Der transepitheliale Widerstand (TER) sowie die para- und transzellulären Widerstände von IPEC-J2 waren bei PS-Kultivierung um eine Größenordnung verringert und die sekretorische Antwort auf Forskolin, verglichen mit IPEC-J2/FBS, verdoppelt. Struktur (Zellform) und Ultrastruktur (TJ-Stränge) von IPEC-J2/PS ähnelten nun denen von Jejunozyten und die Expression von Marker- und TJ-Proteinen war in Richtung fortgeschrittener Reifung verändert. Alle Parameter, die unter PS- Kultivierung gemessen wurden, waren denen porziner Jejunozyten näher als jemals seit der initialen Etablierung des Zellmodells IPEC-J2 im Jahr 1989 berichtet. Somit stellt IPEC-J2/PS das gegenwärtig beste Modell zur Untersuchung der porzin-jejunalen Barrierefunktion dar (ZAKRZEWSKI ET AL., 2013a). Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde der Effekt einer Zinksupplementierung als ein potentielles Prophylaktikum in gesunden Absetzferkeln sowie als eine therapeutische Maßnahme bei der Behandlung TGEV (engl. transmissible gastroenteritis virus)-mediierter intestinaler Erkrankungen bei Absetzferkeln untersucht. Pharmakologische Zinkdosen hatten keine signifikanten elektrophysiologisch erfassbaren Kurzzeiteffekte auf die jejunale Barrierefunktion. Als einziger statistisch relevanter Effekt traten Veränderungen der Barriereparameter in Abhängigkeit mit dem Lebensalter auf. Unter Einbeziehung von Daten anderer Projekte des SFB 852 ergab sich insgesamt, dass in Anbetracht eines mit der Zeit nachteilig werdenden Effekts der Zinksupplementierung lediglich eine Kurzzeitanwendung positiv wirksam ist. Am optimierten Zellsystem IPEC-J2/PS bewirkte Zink einen TER-Anstieg und eine Permeabilitätsabnahme für den parazellulären Marker Fluoreszein – also insgesamt eine Verstärkung der Barriereeigenschaften in vitro. Das Ausbleiben dieses Effekts am nativen Darmepithel ex vivo ist vermutlich auf ein Auswaschen des Zinks während der Gewebepräparation zurückzuführen. Daher scheint für die Barrierestärkung die akute Wirkung von Zink auf das jejunale Epithel essentiell. Für TGEV-infizierte Ferkel im Kurzzeitversuch stellte die prophylaktische Zinksupplementierung hinsichtlich der jejunalen Barrierefunktion einen enormen Vorteil dar. Verglichen mit der Kontrollgruppe führte die pharmakologische Zinkdosis zu einer Verhinderung der Zottenatrophie, Milderung der epithelialen Apoptoserate und Bewahrung der epithelialen Barriere durch Aufrechterhalt des epithelialen Widerstands und Niedrighalten der induzierbaren Chloridsekretion. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass eine pharmakologische Zinksupplementierung das porzine Jejunum vor einer TGEV-Infektion schützen kann (CHAI ET AL., submitted).

In pig breeding, infection-associated diarrhea frequently occurs directly after weaning and is often lethal for weanling piglets. Within the framework of the DFG-funded collaborative research center (CRC) 852, whose overall goal was to increase the weaners’ survival rate, this thesis investigated factors which strengthen or recover the intestinal barrier. The majority of CRC 852 projects were performed by using the porcine jejunal cell line IPEC-J2 and native epithelial explants from porcine gut. The first part of this thesis was based on the finding that the cell culture system IPEC-J2, which has been commonly used during the past decades, did not resemble small bowel epithelium with regard to barrier and transport properties. Effects of nutritional factors therefore could not be reliably investigated. Thus, it was a major aim of the present thesis to convert IPEC-J2 into a valid model and to characterize epithelial architecture, electrophysiology, and expression of epithelial polarization marker proteins and barrier-relevant tight junction (TJ) proteins in both cell systems. For this, IPEC-J2 monolayers were cultivated on permeable supports, either conventionally with fetal bovine serum (FBS) or species-specifically with porcine serum (PS). Porcine jejunal mucosae were analyzed for comparison. Electrophysiological, morphometrical, ultrastructural, and protein biochemical studies revealed that under PS conditions (IPEC-J2/PS), compared to FBS culture (IPEC-J2/FBS), cell height increased 6-fold while the cell diameter was reduced by 50%. In addition, the apical cell membrane of IPEC-J2/PS exhibited typical microvilli. Under PS condition, transepithelial resistance (TER) and trans- and paracellular resistances were reduced by one order of magnitude and the secretory response to forskolin was increased 2-fold, compared to FBS condition. Structure (cell shape) and ultrastructure (TJ strands) of IPEC-J2/PS resembled those of jejunocytes and the expression of epithelial polarization marker and TJ proteins was changed towards advanced maturation. All parameters measured under PS conditions were much closer to those of typical pig jejunocytes than ever reported since the cell line’s initial establishment in 1989. Hence, IPEC-J2/PS monolayers currently represent the most suitable model to investigate porcine jejunal barrier function (ZAKRZEWSKI ET AL., 2013a). The second part of this thesis aimed at investigating the effect of zinc supplementation as a potential prophylactic tool in healthy piglets and as a therapeutical agent in treating TGEV (transmissible gastroenteritis virus)-mediated intestinal disorders in weanling pigs. Pharmacological zinc doses exerted no significant electrophysiologically ascertainable short-term effects on jejunal barrier function. The only statistically relevant effects were age-related changes in barrier parameters. Including other CRC 852 groups’ data, piglets appear to profit solely from a short-term zinc application as adverse effects increase over time. In IPEC-J2/PS, zinc caused an increase in TER and a decrease in permeability to the paracellular marker fluorescein – reflecting an overall barrier strengthening in vitro. Ex vivo however, such effects could not be observed. This is presumed to be due to zinc being washed out during tissue preparation. Thus, with respect to barrier strengthening, the acute presence of zinc seems to be essential. When piglets were virally challenged in a short-term trial, prophylactic zinc had tremendous beneficial effects on jejunal barrier function. Compared to a control group, pharmacological zinc doses prevented villus atrophy, mitigated apoptotic events in enterocytes, and retained the jejunal barrier by maintaining epithelial resistance and by keeping inducible chloride secretion down. These results suggest that high dietary zinc could provide enhanced protection against TGEV infection in piglet jejunum (CHAI ET AL., submitted).