Die Rolle des RALA-Signalweges bei der epithelial-mesenchymalen Transition von Tumorzellen

Abstract

Einleitung Mutierte RAS-Proteine führen zur konstitutiven Aktivierung nachgeschalteter Signalketten und können somit zur epithelial-mesenchymalen Transition (EMT) von Tumorzellen beitragen. Dieser Prozess gilt für viele Tumoren als Voraussetzung zur Metastasierung. RAS-Transformation führt in Ovarialepithelzellen (RAS-ROSE) zur Hochregulation der Transkriptionsfaktoren Slug, Snail und Twist, welche für die EMT-Induktion verantwortlich sind. In dieser Arbeit wurde untersucht, welche Signalwege an der Regulation dieser Faktoren beteiligt sind und ob deren Ausschaltung zur Reversion des Phänotyps führt. Insbesondere wurde dabei auf die Rolle des noch wenig erforschten RALA- Signalweges eingegangen. In den humanen kolorektalen Karzinomzelllinien HCT 116, SW 480 und HT 29 konnte in einer vorausgegangenen Studie RALA-Aktivität nachgewiesen werden. Diese Zellen zeichnen sich durch einen unterschiedlichen KRAS- und BRAF-Mutationsstatus aus. In dieser Arbeit wurden die Migrationseigenschaften der Zellen verglichen und untersucht, ob der RALA- Signalweg an der Migration beteiligt ist. Methodik Slug, Snail, Twist und RALA wurden mittels RNA-Interferenz transient ausgeschaltet. Die Unterbrechung des MAPK- bzw. PI3K-Signalweges geschah mit spezifischen Inhibitoren. Mithilfe des RALA-Pulldown-Assays und anschließendem Western Blot konnte der Aktivierungsgrad von RALA bestimmt werden. Die Regulation von RALA und der EMT-Faktoren wurde auf mRNA-Ebene in der qPCR erfasst. Als Komponenten der EMT wurden die Morphologie der Zellen, Veränderungen im E-Cadherin-Spiegel und die Migrationseigenschaften untersucht. Die Analyse der Migration erfolgte mit in vitro Wundheilungs-Assays. Ergebnisse In RAS-ROSE Zellen ist der RALA- Signalweg aktiv und führt zur Expression der EMT-Transkriptionsfaktoren Slug, Snail und Twist. Der MAPK-Signalweg beeinflusst dabei die Aufrechterhaltung der RALA-Aktivität. Ein transienter Knockdown von Slug, Snail, Twist oder RALA bewirkte keine Veränderung der Zellmorphologie oder der Migration. Die bereits bekannte Migrationshemmung nach MAPK-Inhibition wurde in dieser Arbeit bestätigt. Eine kombinierte Ausschaltung des MAPK- sowie des PI3K-Signalweges konnte die Migration nochmals signifikant verlangsamen. Interessanterweise zeigte sich bei keiner der untersuchten Inhibitor-Kombinationen eine Reversion des E-Cadherin-Spiegels in RAS-ROSE Zellen. In den kolorektalen Zelllinien HCT 116, SW 480 und HT 29 hatte RALA-Knockdown ebenfalls keinen Einfluss auf die Migration der Zellen. Schlussfolgerung In RAS-ROSE Zellen hemmt die kombinierte Ausschaltung des MAPK- und des PI3K-Signalweges die Zellmigration besonders effektiv. Die robuste Suppression von E-Cadherin auch nach Hemmung mehrerer Signalwege lässt auf die Beteiligung weiterer RAS-abhängiger Signalwege schließen. Der RALA-Signalweg ist in beiden untersuchten Zellsystemen nicht für die Migration verantwortlich. Möglicherweise spielt die Isoform RALB hier eine bedeutendere Rolle als angenommen.

Introduction Mutated RAS proteins constitutively activate downstream signaling pathways and can contribute to the epithelial-mesenchymal transition (EMT) of tumor cells. For many tumors, the EMT is a necessary step for metastasis. RAS- mediated transformation of ovarian epithelial cells (RAS-ROSE) leads to upregulation of the transcription factors Slug, Snail, and Twist, which are responsible for the induction of EMT. The primary objective of this study was to investigate which signaling pathways are involved in the regulation of these factors and to evaluate whether knockdown of each transcription factor could reverse the cellular phenotype. The main focus was set on the RALA signaling pathway, as its role during the EMT process is still poorly understood. A previous study was able to show RALA activity in the human colorectal cancer cell lines HCT 116, SW 480, and HT 29. These cells harbor different KRAS or BRAF mutations. This study compared the migration characteristics of the cells and investigated whether RALA signaling is involved. Methods Slug, Snail, Twist, and RALA were transiently knocked down by RNA interference. MAPK and PI3K signaling pathways were blocked by specific inhibitors. RALA activity was assessed by a RALA pulldown assay followed by Western blot analysis. The regulation of RALA and EMT factors was evaluated at the mRNA level by qPCR. The cell morphology, E-Cadherin levels, and migration status were analyzed as components of EMT. Migration was studied by in vitro scratch assays. Results The RALA signaling pathway is active in RAS-ROSE cells and leads to expression of the EMT transcription factors Slug, Snail, and Twist. MAPK pathway contributes to the maintenance of RALA activity. Transient knockdown of Slug, Snail, Twist, or RALA did not influence cell morphology or migration. As previously reported, the inhibition of MAPK resulted in partial reversion of EMT and reduced migration. Furthermore this study was able to show that combined inhibition of both MAPK and PI3K led to a significantly slower migration rate. Interestingly, reversion of E-Cadherin levels in RAS- ROSE cells did not occur under any of the inhibitor combinations studied. RALA knockdown had no influence on cell migration in the colorectal cancer cell lines HCT 116, SW 480, and HT 29. Conclusion Combined inhibition of the MAPK and PI3K signaling pathways strongly reduces cell migration in RAS-ROSE cells. The robust suppression of E-Cadherin after inhibition of various signaling pathways suggests the involvement of other RAS-dependent pathways. In both evaluated cell systems RALA knockdown did not influence migration. Perhaps the isoform RALB plays a more prominent role than has been assumed.