Neuartige Adenoviren nicht-humaner Primaten: hohe genetische Diversität und Hinweise auf Rekombinationen und zoonotische Übertragungen

Abstract

Adenoviren sind in der Lage, ein breites Wirbeltierspektrum zu infizieren, unter ihnen eine Vielzahl nicht-humaner Primaten. Die vorliegende Arbeit beschäftigte sich mit folgenden Fragestellungen: (i) Kommen AdVs bei wildlebenden nicht-humanen Primaten vor? (ii) Wie sind ihre phylogenetischen Eigenschaften? (iii) Besteht Potenzial einer zoonotischen Übertragung zwischen Menschen und nicht menschlichen Primaten? (iv) Lassen sich Rekombinationen bei AdVs wildlebender Primaten beobachten? Hierzu wurden 1285 Proben simianer Herkunft untersucht. Kot erwies sich als sehr geeignetes Probenmaterial zum AdV-Nachweis. Es konnten insgesamt 46 neuartige AdVs mittels degenerierter PCR Assays detektiert werden. Von ihnen stehen DPOL-Teilsequenzen zur Verfügung. Bei 29 gelang zusätzlich aus der gleichen Probe die Amplifikation des nahezu gesamten Hexon-Gens. Ob DPOL- und Hexon-Sequenzen aus einer Probe vom gleichen Virusgenom stammten, war nicht zu ermitteln. Deshalb wurden DPOL- und Hexon- Teilsequenzen getrennt betrachtet. Zusätzlich gelang es, ein AdV aus im Münsteraner Allwetterzoo gehaltenen Gorillas anzuzüchten und zu sequenzieren. Bei diesem AdV konnten DPOL- und Hexonsequenzen miteinander verbunden werden, wodurch eine Teilsequenz von 15.6 kb Länge für Vergleiche mit Genomen anderer AdVs und phylogenetische Untersuchungen zur Verfügung stand. Die Berechnungen phylogenetischer Stammbäume ergaben für Nukleinsäureteilsequenzen des DPOL- und Hexon-Gens eine hohe genetische Diversität. Die neuartigen AdVs gruppierten sich innerhalb aller etablierten humanen und simianen AdV-Spezies ein. Sieben AdVs von Altweltaffen bildeten eigene Kluster und konnten keiner bekannten AdV-Spezies zugeordnet werden. Zusätzlich konnten erstmalig Sequenzen von zwei distinkten AdVs aus Neuweltaffen nachgewiesen und phylogenetisch analysiert werden. Fünf in wildlebenden Schimpansen gefundene AdVs gaben Hinweise auf zoonotische Übertragungen zwischen Mensch und Schimpanse [PtroAdV-8 [HAdV-A], PtroAdV-10 [HAdV-D], PtroAdV-3 [HAdV-F], PtroAdV-7 [HAdV-B] und PtroAdV-14 [HAdV-E]]. Dies zeigt erstmalig, dass AdVs aus wildlebenden Menschenaffen große phylogenetische Ähnlichkeiten zu humanen AdVs aufweisen können. Allerdings wurden nur für einige AdVs Hinweise auf die Richtung der Übertragung erhalten. Um das zoonotische Potential von AdVs nicht humaner Primaten besser abzuklären zu können, sollten in Zukunft auch humane AdVs der gleichen Regionen identifiziert werden und Eingang in die phylogenetische Untersuchungen finden. Trotz Bemühungen, DPOL- und Hexon- Genteilsequenzen der AdVs wilder NHP miteinander zu verbinden, gelang dies nur bei dem angezüchteten AdV GgorAdV-B7. Deshalb wurde auch nur die Genom- Teilsequenz dieses AdV (15.6kb Länge) auf Rekombinationsereignisse untersucht. Die BLAST-Analyse der gesamten Nukleinsäureteilsequenz ergab, dass GgorAdV-B7 die größte Ähnlichkeit zu dem Schimpansen AdV SAdV-35.1 und dem humanen AdV HAdV-21 hat. Zusätzlich wurden phylogenetische Stammbäume der Gene DPOL, pTP, Penton und Hexon berechnet. Sie zeigten, dass GgorAdV-B7 in jedem Gen mit unterschiedlichen AdVs Gruppen bildete. So ist GgorAdV-B7 im DPOL- und pTP-Gen eng mit einer Vielzahl von AdVs von Gorillas und Schimpansen gruppiert. Im Hexon-Gen gruppiert es sich mit dem Schimpansen AdV SAdV-35.1, dem Bonobo AdV SAdV-35.2 und drei humanen AdVs (HAdV-11, HAdV-21 und HAdV-35). Die Nukleinsäuresequenz des Penton-Gens von GgorAdV-B7 hingegen ist nahezu identisch mit der Nukleinsäuresequenz des Penton-Gens des Schimpansen AdV SAdV-29. Diese unterschiedliche Gruppenbildung ist nicht durch eine koevolutionäre Entwicklung von GgorAdV-B7 mit seinem Wirt erklärbar, sondern Inter-Spezies-Übertragungen und Rekombinationsereignisse müssen ebenso eine Rolle gespielt haben. Insbesondere im Penton-Gen gibt es Hinweise auf ein Rekombinationsereignis zwischen AdVs unterschiedlicher Wirte. Elternviren konnten jedoch nicht identifiziert werden. Die Erkenntnisse dieser Arbeit lassen davon ausgehen, dass AdVs über ein nicht zu vernachlässigendes zoonotisches Potential verfügen und ihre phylogenetische Diversität durch Rekombinationsereignisse erhöht wird. Ob AdVs nicht humanen Ursprungs bereits in lokalen afrikanischen Bevölkerungsgruppen oder AdVs humanen Ursprungs in Affenpopulationen zirkulieren, ist bisher kaum abschätzbar. Im Hinblick auf die Gefährdung der Bevölkerung durch Pathogene zoonotischen Ursprungs und einhergehende Belastung der öffentlichen Gesundheitssysteme können Erkenntnisse und Nachweissysteme, wie die hier vorgelegten helfen, frühzeitig Risiken zu erkennen und Gegenmaßnahmen einzuleiten.

Adenoviruses (AdVs) broadly infect vertebrate hosts including a variety of primates. The present study assessed the following questions: (i) Are AdVs present in wild nonhuman primates (NHPs)? (ii) How are their phylogenetic properties? (iii) Is there evidence for interspecies transmission between humans and NHPs? (iv) Do recombination events occur among AdVs of NHPs? A total of 1285 samples of simian origin were analyzed for the presence of AdVs with a panprimate AdV-specific PCR targeting a highly conserved region of the DNA polymerase (DPOL) gene. With this approach a plethora of novel AdV sequences were identified, representing at least 46 distinct AdVs. Of these, 29 nearly complete hexon genes could be amplified. DPOL and hexon sequence from a given sample could not be connected by longdistance PCR. Therefore, only the hexon sequences were the basis for tentative virus names. In addition we identified a novel AdV in the faeces of captive gorillas living in the Zoological gardens of Münster by isolation in cell culture and PCR. Hexon and DPOL gene sequences of this particular virus could be connected by amplification of the in-between sequence resulting in a final sequence of 15.6 kb. Phylogenetic analysis performed in Maximum Likelihood frameworks revealed a high level of genetic diversity of the novel AdVs. They exhibited a broad evolutionary spectrum and were tentatively allocated to all established human and simian AdV species. Seven AdVs of Old World monkeys (OWMs) grouped separately and could not be assigned to any known AdV species. Furthermore, three DPOL sequences were identified in New World monkeys (NWMs) that clustered in a well-separated clade at the base of the primate AdV tree, possibly reflecting the split between NWMs and OWMs. Five AdVs detected in wild chimpanzees revealed a remarkably close relationship to human AdVs over their entire hexon gene sequence, and thus provide evidence for interspecies transmission events between humans and chimpanzees. The directionality of these transmissions could not be firmly determined. Namely these viruses are: PtroAdV-8 [HAdV-A], PtroAdV-10 [HAdV-D], PtroAdV-3 [HAdV-F], PtroAdV-7 [HAdV-B], and PtroAdV- 14 [HAdV-E]. The 15.6 kb sequence of GgorAdV-B7 was subjected to recombination analyses. In BLAST analysis of GenBank, the whole sequence was most closely related to the chimpanzee AdV SAdV-35.1 and the human AdV HAdV-21. Phylogenetic trees were constructed for DPOL, pTP, penton base and hexon gene alignments, revealing a mixed clustering of GgorAdV-B7 with different AdVs in each phylogenetic tree. In the DPOL and the pTP gene, GgorAdV-B7 formed a tight clade with AdVs from chimpanzees and gorillas. In the hexon gene GgorAdV-B7 was most closely associated with one chimpanzee AdV SAdV- 35.1, one bonobo AdV SAdV-35.2 and three human AdVs (HAdV-11, -21, and -35). However, the penton base gene of GgorAdV-B7 showed a striking similarity to that of the chimpanzee AdV SAdV-29. Taken together, these observations cannot be explained by cospeciation of GgorAdV-B7 with its gorilla host. Rather, they are in line with recombination and host switching, and the striking similarity to SAdV-29 suggests that recombination events between AdVs of different host species might take place. In light of current knowledge, parent viruses could not be assigned, indicating a more ancient recombination event with subsequent genetic drift or recombination with an unknown AdV. The high variety of known and novel AdVs of NHPs calls for larger studies to understand the diversity of AdVs currently circulating in African NHPs as well as in local African human populations. This may answer the intriguing question of whether NHPs and humans have an intersected “adeno-virosphere” and may provide the basis for elucidating the potential pathological consequences of interspecies AdV transmission. Studies of this kind may help to establish a global early warning system for emerging diseases, given the need to protect both public health and endangered NHPs.