Microcalorimetric and Microbiological in vitro Investigations on the Acaricidal, Insecticidal, and Antimicrobial Effects of Propolis

Abstract

The energy and nutritional demands of the parasitic lifestyle of Varroa mites have been demonstrated in this thesis, for the first time, through mite starvation and calorimetric experiments. The mites suck up to 28% of the non- replenishable reserve food of the capped brood that otherwise would have been consumed by the pupa during metamorphosis. This in turn leads to the emergence of crippled bees, and can be aggravated by viral, bacterial, and fungal infections. The antivarroa action of propolis (bee glue) has been investigated for the first time calorimetrically, respirometrically, and using the Petridish bioassay method. Propolis samples collected from different geographic origins showed Varroa narcotizing and varroacidal effects. The length of narcosis and mortality rate of mites depended on the solvent of extraction (70% or 40% ethanol, or water), concentration of propolis, and contact time. Propolis extracted in 70% ethanol has been found to be highly toxic, resulting in the death of 80% to 100% mites regardless of the contact time and concentration of propolis. The treatment with 40% ethanol-extracted propolis was less effective, followed by the water extracted propolis. The insecticidal action of propolis has been demonstrated by dipping the different larval stages of the greater wax moth Galleria mellonella in ethanol-extracted propolis for 30 s. The treatment with propolis narcotized the larvae, and reduced their metabolic rates remarkably. Higher concentrations of propolis such as 10% (w/v) caused larval mortality, whereas lower ones (1% and 2%) displayed insect growth regulator actions by shortening the length of pupal metamorphosis. A 4% w/v propolis resulted in the abortion of metamorphosis. The antimicrobial actions of different extracts of propolis from various geographic origins were compared by using parameters such as the minimal inhibitory concentrations (MIC), minimal bactericidal concentrations (MBC), diameter of the inhibition zone, and several parameters of the heat production rate vs. time (p-t) curves. For all propolis samples tested, the strength of antimicrobial activity decreased in the order of ethanol-extracted propolis (EEP), propolis volatiles (PV), and water-extracted propolis (WEP). For some propolis samples, however, there was no remarkable difference in the strength of antimicrobial activities between EEP and PV. The extraction of propolis with ethanol procures all water soluble, ethanol soluble, and the volatile components of propolis making EEP superior to the other two extracts qualitatively and/or quantitatively. The Gram positive bacteria were more sensitive to propolis treatments than the Gram negative ones and the fungi. The lower sensitivity of Gram negative bacteria can be accounted for by the impermeability of their outer membrane to antibacterial agents. Filamentous fungi were less sensitive to propolis treatment than yeasts, the latter showing higher diameters of inhibition zones especially at higher propolis concentrations. The antimicrobial, insecticidal, and acaricidal actions of propolis illustrated here show that propolis can be used in the control of parasites, pests and pathogens of the honeybees.

In dieser Arbeit wurde zum ersten Mal die genaue Energiemenge bestimmt, die die Varroa-Milbe den Bienen durch ihren parasitischen Lebensstil entzieht. Der Energiebedarf wurde durch das Aushungern der Milben und kalorimetrische Versuche ermittelt. Die Milben verbrauchen bis zu 28% der Futterreserven der verdeckelten Brut. Diese Reserven werden nicht wieder ergänzt, so dass die Nahrung den Puppen während der Metamorphose fehlt. Daher schlüpfen aus den befallenen Zellen Bienen, die unter dem typischen ?Milben-Syndrom? leiden und aufgrund ihrer geschwächten Konstitution leicht das Opfer von Infektionen werden. Die Wirkung von Propolis gegen Varroa-Milben ist in dieser Arbeit zum ersten Mal mit kalorimetrischen, respirometrischen und Petrischalen Experimenten untersucht worden. Propolis, das aus verschiedenen Regionen und Kontinenten stammte, narkotisierte und tötete die Milben. Die Länge der Narkose und die Mortalitätsrate der Milbe hing von der Wahl des Lösungsmittels, von der Propolis-Konzentration und von der Dauer des Kontaktes ab. Propolis, dass in 70%-igem Äthanol gelöst wurde, wirkte hochgradig giftig auf die Milben. Es tötete 80 bis 100% der Milben, unabhängig von der Dauer des Kontaktes und der Konzentration. Die Behandlung mit Propolis, dass in 40%-igem Äthanol gelöst wurde, war weniger effektiv, gefolgt von in Wasser gelöstem Propolis. Die insektizide Wirkung von Propolis wurde gezeigt, indem die verschiedenen Entwicklungsstadien der Großen Wachsmotte Galleria mellonella für 30 Sekunden in äthanol-gelöstes Propolis getaucht wurden. Diese Behandlung betäubte die Larven und reduzierte ihre Stoffwechselrate beträchtlich. Höhere Propolis-Konzentrationen (10% w/v) führten zum Tod der Larven, während niedrigere Konzentrationen (1% und 2%) sich regulativ auf das Larvenwachstum auswirkten und zur Verkürzung der Metamorphose führten. Eine 4%-ige Lösung führte zum Abbruch der Metamorphose. Die antimikrobielle Wirkung der Propolisextrakte aus verschiedenen geographischen Regionen wurde anhand von Parametern wie der Minimalen inhibitorischen Konzentration (MIK), der Minimalen bakteriziden Konzentration (MBK), dem Durchmesser der Hemmhöfe und einigen Parametern der Wärmeproduktionsrate / Zeit (p-t) Kurven verglichen. Bei allen untersuchten Proben zeigte das in Äthanol gelöste Propolis (EEP) die stärkste antimikrobielle Wirkung, gefolgt von den flüchtigen Substanzen im Propolis (PV) und in Wasser gelöstem Propolis (WEP). Bei einigen Proben gab es nur geringe Unterschiede zwischen PV und EEP. Löst man Propolis in Äthanol, enthält dieser Ansatz alle wasserlöslichen, alkolhollöslichen und flüchtigen Komponenten des Propolis. Dadurch ist in Äthanol gelöstes Propolis den beiden anderen Formen qualitativ und quantitativ überlegen. Grampositive Bakterien verhielten sich gegenüber Propolis grundsätzlich empfindlicher als gramnegative Bakterien und als Pilze. Die geringere Empfindlichkeit der gramnegativen Bakterien könnte darin begründet liegen, dass ihre äußere Membran für antibakterielle Substanzen undurchdringlich ist. Schimmelpilze waren Propolis gegenüber unempfindlicher als Hefen. Bei letzteren hatten die Hemmhöfe größere Durchmesser; insbesondere bei höheren Propolis- Konzentrationen. Die hier beschriebenen antimikrobiellen, insektiziden und akariziden Wirkungen von Propolis zeigen, dass Propolis als Mittel gegen die Parasiten, Seuchen und Krankheitserreger der Honigbiene eingesetzt werden kann.