Identifizierung von Liganden des G-Protein gekoppelten Rezeptors Mas und Mas- Sequenz-ähnlicher Rezeptoren

Abstract

Lange galt Angiotensin (Ang)II als einziges aktives Peptid des Renin- Agiotensin-Systems (RAS). Inzwischen sind weitere Peptide bekannt, deren Bedeutung in der Pathogenese von kardiovaskulären Erkrankungen bisher nur partiell beschrieben wurden und die durch hydrolytische Abspaltung zu Ang III [Ang-2-8)], Ang IV [Ang-3-8] und Ang-(1-7) umgewandelt werden. Die Aktivierung des G-Protein gekoppelten Rezeptors (GPCR) Mas führt über einen Signalweg zur Freisetzung von Arachidonsäure (AA). Mas-transfizierte COS-7-Zellen wurden hinsichtlich ihrer AA-Freisetzung nach Inkubation mit verschiedenen Peptiden, Nicht-Peptiden und Neuro-Peptiden untersucht. Als Kontrolle wurden COS-7-Zellen, die nur mit dem Kontrollplasmid pcDNA transfiziert wurden, verwendet. AA wurde 18 Stunden vor der Inkubation (15 Minuten) mit den Peptiden zu den stabil transfizierten Zellen zugefügt. Die daraufhin freigesetzte Menge an AA wurde über Flüssigszintigraphie ermittelt. Es wurde die Funktion des Ang-(1-7) als ein Ligand des Mas-Rezeptors und ebenfalls des spezifischen Antagonisten A779 des Ang-(1-7) am Mas-Rezeptor erfasst. Bei den nur pcDNA-transfizierten Zellen (Leervektor) kam es nach Behandlung mit Ang-(1-7), AVE0991, Ang II, Ang III und Ang IV zu signifikanten AA-Anstiegen. Daraus lässt sich schließen, dass der Mas-Rezeptor auch in COS-7-Zellen exprimiert wird. Bei allen getesteten Konzentrationen von Ang-(1-7) kam es zu hochsignifikanter AA-Freisetzung. Nach Behandlung mit A779 kam es zu einer kompletten Hemmung der durch Ang-(1-7) hervorgerufenen AA-Freisetzung. Die AT1- und AT2-Blocker PD123319 und Irbesartan konnten die Wirkung des Ang-(1-7) nicht antagonisieren, wodurch gezeigt werden konnte, dass der Ang-(1-7)-Rezeptor sich von den klassischen Ang II-Rezeptoren AT1 und AT2 deutlich unterscheidet. Das Nicht-Peptid AVE0991, welches als Mas-Rezeptor- Agonist gilt, führte bei den pcDNA-transfizierten Zellen im Vergleich zu den unbehandelten Zellen zu signifikanter AA-Freisetzung, nicht aber bei den Mas- transfizierten Zellen vs. den pcDNA-transfizierten Zellen. Auch Ang I und Ang II führten bei den Mas-transfizierten Zellen vs. den pcDNA-transfizierten Zellen nur zu geringen AA-Freisetzungen, während es Ang III-, Ang IV- und Substanz P-vermittelt zu höheren AA-Freisetzungen kam und sich anhand dessen eine direkte Interaktion nachweisen ließ. Eine indirekte Wirkung durch eine verstärkte Expression der Ang II- und Ang IV-Rezeptoren konnte anhand dieser Experimente jedoch nicht ausgeschlossen werden. Aufgrund ihrer Sequenz- homologien zu HSMas wurden auch die Rezeptoren MMMrgH, HSMrgX2, HSMrgX1, HSMrgD, HSMrgF und HSMRG in der hier vorliegenden Arbeit untersucht. Während Ang IV beim MrgH-Rezeptor zu einem signifikanten AA-Anstieg führte, konnte am MrgX2-Rezeptor durch Ang IV und Ang III eine Interaktion über die AA- Freisetzung nachgewiesen werden. Am MrgX1-Rezeptor waren es Substanz P, AVE0991 und Ang IV, die als mögliche Liganden identifiziert werden konnten. Ang IV und Ang-(1-7) zeigten bei den MrgD-transfizierten Zellen hohe AA- Freisetzung. Im Gegensatz dazu kam es bei keinem der untersuchten Peptide zu signifikanter AA-Freisetzung nach Inkubation mit den MrgF-transfizierten Zellen. Für MRG konnte eine Interaktion mit Ang IV, Ang-(1-7) und Ang II über die AA-Freisetzung beobachtet werden, womit diese Peptide als mögliche Liganden zur Diskussion stehen. Die hier vorgelegte Studie liefert eine molekularbiologische Basis für die Interaktion zwischen Mas und Ang-(1-7) sowie des spezifischen Antagonisten A779. Die Ergebnisse eröffnen neue Wege in der Behandlung kardiovaskulärer Erkrankungen durch Manipulation des Mas- Rezeptors. Die Daten dieser Arbeit zeigen die Komplexität des RAS auf, bei dem Ang-Metaboliten und Nicht-Ang-Metaboliten mit verschiedenen Rezeptoren der Mrg-Familie interagieren und diverse, zum Teil gegensätzliche biologische Informationen übermittelt werden. Erstmalig konnten direkte, Ang IV-induzierte Effekte über GPCRs beschrieben werden, welche unabhängig von den partiellen agonistischen Effekten auf den AT1-Rezeptor sind. Auch Ang II und Ang III ver- mitteln eine Rezeptoraktivierung unabhängig von ihren spezifischen Rezeptoren AT1 und AT2. Die Neuro-Peptide NPFF und NPAF wurden in der Studie von Dong et al. bereits als Mas-Liganden diskutiert. In der hier vorliegenden Studie wurde die AA-Freisetzung nach Be-handlung der HSMas-, MMMrgH- und HSMrgX1-Rezeptoren mit NPFF, NPAF, NPSF und A779 untersucht. Das Neuro-Peptid NPFF zeigte am humanen Mas-Rezeptor deutliche AA-Freisetzung. Auch die Kontrollzellen führten zu signifikanten AA-Anstiegen. Die AA-Freisetzung durch NPFF wurde durch A779 aufgehoben. A779 ist damit ein möglicher Antagonist für NPFF am Mas-Rezeptor. Nur NPAF lieferte in einer hohen Konzentration einen geringen AA-Anstieg. NPSF vermochte bei den Mas-transfizierten Zellen in allen Konzentrationen einen signifikanten AA-Anstieg zu bewirken und führte nach Behandlung mit A779 zu einer partiellen Antagonisierung. NPFF und NPSF sind damit mögliche Liganden am Mas-Rezeptor. Am MMMrgH-Rezeptor führten NPFF, NPAF und NPSF zu signifikanten AA-Anstiegen, die damit mögliche Liganden an diesem Rezeptor sind. Der durch NPFF, NPAF und NPSF hervorgerufene AA-Anstieg wurde durch A779 partiell antagonisiert. Beim HSMrgX1-Rezeptor wurde keine Interaktion mit den Neuro-Peptiden NPFF, NPAF und NPSF sowie kein Antagonismus durch A779 festgestellt. Die Daten zeigen, dass die Neuro-Peptide am Mas-Rezeptor wirken. Sie könnten die Nozizeption in vivo modulieren und bei neuronalen Erkrankungen eingesetzt werden.

In earlier studies, angiotensin (Ang) II was thought to be the only active peptide in the renin angiotensin system (RAS). Recently, several peptides have been discovered whose role in the pathogenesis of cardiovascular diseases has only been partially described and which are cleaved to form Ang III [Ang-(2-8)], Ang IV [Ang-(3-8)] and Ang-(1-7). Activation of the G-protein- coupled receptor Mas stimulates the release of arachidonic acid (AA) via a signaling pathway. We analyzed AA release after incubating Mas-transfected COS cells with several nonpeptides, peptides and neuropeptides. COS cells transfected with the control plasmid pcDNA were used as a control. After preloading the stably transfected cells with tritium-AA (18 hours beforehand), they were stimulated with the indicated peptides for 15 minutes. The amount of AA released was measured using liquid scintillation spectrometry. The function of Ang-(1-7) as a ligand for the Mas receptor and of A779 as a specific Ang-(1-7) antagonist of the Mas receptor was detected. Ang-(1-7), AVE0991, Ang II, Ang III and Ang IV induced significant AA release in cells transfected only with pcDNA (empty vector). This suggests that Mas may be expressed in COS-7 cells. At all concentrations of Ang-(1-7) tested there was a significant increase in AA release induced. After incubation with A779 the Ang-(1-7)-induced AA release was completely abolished. The AT1 and AT2 receptor antagonist PD123319 and irbesartan were not able to antagonize the effect of Ang-(1-7), suggesting that the Ang-(1-7) receptor is distinct from the classical Ang II receptors AT1 and AT2. The nonpeptide AVE0991, which is thought to be a Mas receptor agonist, stimulated a significant increase in AA release in pcDNA-transfected cells compared to nonstimulated, nontransfected cells but not in Mas-transfected cells compared to pcDNA-transfected cells. Ang I and Ang II caused a low increase in AA release in Mas-transfected cells compared to pcDNA-transfected cells, whereas Ang III, Ang IV and substance P initiated a higher AA release. These results demonstrate a direct interaction between the selected peptides and the Mas receptor. Based on these experiments we could not exclude that the action may also be indirect, for example, as a result of overexpression of Ang II or Ang IV receptors based on the interaction of the peptides with Mas. The receptors MMMrgH, HSMrgX2, HSMrgX1, HSMrgD, HSMrgF and HSMRG were also examined, because they share strong sequence homology to HSMas. The receptor MrgH showed a significant increase AA release after Ang IV stimulation, while the MrgX2 receptor mediated an increase in AA released following Ang IV and Ang III stimulation; substance P, AVE0991 and Ang IV could be identified as possible ligands for the MrgX1 receptor. Ang IV and Ang-(1-7) induced high AA release in MrgD-transfected cells. After peptide and non-peptide treatment HSMrgF showed no significant AA release. HSMRG initiated AA release after stimulation of the receptor with Ang IV, Ang-(1-7) and Ang II, indicating that these peptides may be possible ligands for this receptor. The findings of this study provide a clear molecular basis for the interaction of Ang-(1-7) with Mas and with the Ang-(1-7)-specific antagonist A779. Our results clearly broaden the possibilities for treating cardiovascular diseases by manipulating the Mas receptor. The data presented in this thesis support the complexity of the RAS, that is, Ang metabolites and non-Ang metabolites interact with several receptors in the Mas-related gene family to convey a diversity of biological information. We describe for the first time AT1-independent, direct Ang IV signaling mediated by a G-protein-coupled receptor (GPCR) and show that Ang II and Ang III initiate signaling independent of their receptors AT1 and AT2. The neuropeptides NPFF and NPAF were discussed as Mas agonists by Dong et al. In the present study we examined AA release after stimulating the receptors HSMas, HSMrgX1, MMMrgH with NPFF, NPAF, NPSF and A779. The neuropeptide NPFF induced a significant AA release in HSMas-transfected cells. The control cells also induced a significant AA release. The NPFF-induced increase in AA release was abolished with A779. We conclude that A779 is a possible antagonist of NPFF for the HSMas receptor. Only NPAF at high concentrations induced a low AA release. At all concentrations NPSF induced a significant AA release in HSMas- transfected cells, and this effect could be partially blocked by A779. NPFF and NPSF are therefore possible ligands for this receptor. The MMMrgH receptor induced significant AA release in response to NPFF, NPAF and NPSF stimulation. These peptides are possible ligands for this receptor. The NPSF-induced AA release was partially blocked by A779. In the HSMrgX1 receptor there was no interaction with the neuropeptides NPFF, NPAF and NPSF and no antagonism by A779 found. The data show that the neuropeptides interact with the Mas receptor. They may modulate nociception in vivo and may be used for treatment of neuronal diseases.