Arrayed cDNA libraries for antibody screening and systematic analysis of expression products

Abstract

Functional analysis of the proteins expressed in a specific tissue and/or stage of development is an essential step towards understanding biological processes. No technique has yet been available to go directly from sequence information on individual cDNA clones to the protein products. In the approach described here, arrayed cDNA expression libraries from human fetal brain (hEx1) and mouse adult kidney (mKd1) were established for the integration of DNA-based and protein-based experimental data. An E. coli plasmid vector (pQE30NST) for the expression of His6-tag fusion proteins was used to clone cDNA synthesised by oligo(dT) priming. Using automated systems, 27,600 clones of the mKd1 and 193,500 clones of the hEx1 library were picked, grown in microtitre plates and arrayed on membrane filters at a density of 9,216 or 27,648 clones per filter. High-density DNA and protein filters were prepared and used to screen the cDNA libraries with DNA probes and antibodies in parallel. An antibody directed against the N-terminal tag sequence RGSH6 of proteins expressed from pQE30NST (RGS·His antibody, Qiagen) was used to detect expression clones. Approximately 20% of clones in the mKd1 and hEx1 cDNA libraries were detected as putative expression clones by this antibody. 37,830 putative expression clones in the hEx1 library were combined and rearrayed into new microtitre plates. A copy of this sub-library was given to the Resource Centre of the German Human Genome Project (RZPD, http://www.rzpd.de) to generate and distribute high-density DNA and protein filters. Expression products and DNA sequences of 96 randomly selected clones were analysed in detail. Protein expression and purification in microtitre plates was established. 68 out of 96 clones expressed proteins of at least 15 kd size (estimated from SDS-PAGE) which were detected by SDS-PAGE of whole cellular proteins or by metal affinity chromatography. DNA sequences derived from 5´-ends of cDNA inserts were obtained for 93 clones. 58 sequences matched human protein sequences in the SWISS-PROT and TrEMBL databases. 38 (66%) of these 58 sequences contained inserts cloned in the correct reading frame, i.e. the His6-tag and a protein coding cDNA sequence were fused in frame. 66% of sequences matched to the beginning of a protein database sequence, and the corresponding clones were therefore considered to contain complete protein- coding regions (full-length clones). Expression clones for a panel of human genes were identified in the hEx1 library. Nine cDNA probes for BMP-7, calmodulin, COX4, GAPDH, hMSH2, HSP90a, HSP90b, RXRb and VDAC1 were used for screening by DNA hybridisation. Among the positive clones, putative expression clones were selected that were also detected by the RGS·His antibody on high- density filters. Expression clones for seven genes, but not for BMP-7 and VDAC1, were found with this strategy. GAPDH and calmodulin clones comprising full protein-coding regions expressing soluble His6-tag fusion proteins were identified. Biological activity of His6-tag GAPDH and calmodulin fusion proteins was shown with enzyme assays. DNA probes and the RGS·His antibody were used in combination to detect clones expressing GAPDH and HSP90a fusion proteins. In parallel, specific antibodies directed against GAPDH and HSP90a were used to identify expression clones on high-density protein filters. All clones identified by the protein-specific antibodies expressing His6-tag GAPDH or HSP90a fusion proteins were reliably detected by the RGS·His antibody. The RGS·His detected additional clones, which either contained GAPDH or HSP90a inserts in an incorrect reading frame, or which expressed truncated proteins lacking the epitopes recognised by the protein-specific antibody. Estimated 90% of clones with inserts in an incorrect reading frame were not detected by the RGS·His antibody. A protocol for the analysis of His6-tag fusion proteins by matrix assisted laser ionisation/desorption mass spectrometry (MALDI-MS) was established. His6-fusion proteins were purified under denaturing conditions by immobilisation on Ni2+-chelate-coated magnetic beads, followed by direct digestion with trypsin. The masses of the tryptic peptides were measured and compared to masses predicted from sequences in databases. Arraying of cDNA expression libraries extends the application of DNA library arrays to protein-based screening techniques, thus creating a direct link between DNA-based and protein-based experimental data. The hEx1 expression library allows for the fast identification of expression clones for specific genes by DNA hybridisation or antibody screening. Proteins expressed from library clones can be directly used for functional assays, or, if inclusion bodies are formed, may be used as antigens to generate antibodies or possibly refolded in vitro. Libraries of expression clones displayed on high-density filters, in combination with high-throughput protein expression and purification in microtitre plates, should be a feasible approach to the construction of gene product catalogues.

Die funktionelle Analyse der Proteine, die in bestimmten Geweben und/oder Entwicklungsstadien exprimiert werden, ist unverzichtbar für das Verständnis biologischer Vorgänge. Bis heute steht keine Technik zur Verfügung, um direkt von Sequenzinformation individueller cDNA Klone zu den Proteinprodukten zu gelangen. Bei der hier beschriebenen Vorgehensweise wurden geordnete cDNA Expressionsbanken aus humanem Fötalgewebe (hEx1) und Maus Nierengewebe (mKd1) hergestellt, um experimentelle Daten, die auf DNA-Basis oder Proteinbasis gewonnen wurden, integrieren zu können. Ein E. coli Plasmidvektor (pQE30NST) für die Expression His6-markierter Fusionsproteine wurde für die Klonierung von cDNA benutzt, die mit einem oligo(dT) Primer synthetisiert wurde. 27.600 Klone der mKd1 und 193.000 Klone der hEx1 Bank wurden mit Hilfe von Robotern gepickt, in Mikrotiterplatten wachsen gelassen und auf Membranfiltern mit einer Dichte von 9.216 oder 27.648 Klonen pro Filtern angeordnet. Hochdichte- DNA und Proteinfilter wurden auf diese Art hergestellt und für das parallele Screening der cDNA-Banken mit DNA-Sonden und Antikörpern benutzt. Ein Antikörper gegen die N-terminale Sequenz RGSH6 von Proteinen, die mit dem pQE30NST Vektor exprimiert wurden, wurde benutzt, um Expressionsklone zu identifizieren. Ungefähr 20% der Klone der mKd1 und hEx1 cDNA Banken wurden durch diesen Antikörper als mutmaßliche Expressionsklone identifiziert. 37.830 mutmaßliche Expressionsklone der hEx1 cDNA-Bank wurden zusammengefaßt und neu in Mikrotiterplatten angeordnet. Eine Kopie dieser neuen cDNA-Bank wurde dem Ressourcenzentrum im Deutschen Humangenomprojekt (RZPD, http://www.rzpd.de) für die Herstellung und Verteilung von Hoch-Dichte DNA- und Proteinfiltern gegeben. Die Expressionsprodukte und DNA-Sequenzen von 96 zufällig ausgewählten Klonen wurden analysiert. Zu diesem Zweck wurde die Expression und Reinigung von Proteinen in Mikrotiterplatten etabliert. 68 von 96 Klonen exprimierte Proteine von mindestens 15 kd Größe (bestimmt durch SDS- Gelelektrophorese), die nach SDS-Gelelektrophorese von Gesamtzellproteinen oder nach Metall-Affinitätschromatographie nachgewiesen wurden. cDNA-Inserts von 93 Klonen wurden vom 5´-Ende her ansequenziert. 58 dieser Sequenzen entsprachen Proteinsequenzen in der SWISS-PROT und TrEMBL Datenbank. 38 (66%) dieser 58 Sequenzen enthielten Inserts, die im richtigen Leseraster kloniert waren, d.h. die His6-Sequenz auf dem Vektor und eine Protein-kodierende cDNA Sequenz waren im richtigen Leseraster fusioniert. 66% war der Anteil der Sequenzen, die mit dem Anfang einer Proteinsequenz übereinstimmten, und von denen deshalb angenommen wurde, daß sie eine vollständige Protein-kodierende Sequenz enthalten (ýfull-length Klone"). In der hEx1 Bibliothek wurden Expressionsklone für eine Auswahl menschlicher Gene identifiziert. Neun cDNA- Sonden für BMP-7, Calmodulin, COX4, GAPDH, hMSH2, HSP90a, HSP90b, RXRb und VDAC1 wurden für DNA-Hybridisierungs-Screenings benutzt. Unter den positiven Klonen wurden solche Klone, die auch durch den RGS·His-Antikörper detektiert wurden, als mutmaßliche Expressionsklone betrachtet. Expressionsklone für sieben Gene, jedoch nicht für BMP-7 und VDAC1, wurden so gefunden. Biologische Aktivität von His6-GAPDH und Calmodulin Fusionsproteinen wurde durch Enzym- Assays nachgewiesen. DNA-Sonden und der RGS·His Antikörper wurden in Kombination eingesetzt, um Klone zu identifizieren, die GAPDH und HSP90a Fusionsproteine exprimieren. Parallel dazu wurden spezifische Antikörper gegen GAPDH und HSP90a eingesetzt, um Expressionsklone auf Hochdichte-Proteinfiltern zu identifizieren. Alle Klone, die von den Protein-spezifischen Antikörper erkannt wurden und His6-GAPDH oder HSP90a Fusionsproteine exprimierten, wurde auch von dem RGS·His Antikörpern erkannt. Der RGS·His Antikörper detektierte weitere Klone, die GAPDH oder HSP90a Inserts enthielten, die entweder nicht im richtigen Leseraster kloniert waren, oder bei denen es sich um Teilsequenzen handelte, die nicht die von den Protein-spezifischen Antikörper erkannten Epitope umfaßten. Ungefähr 90% der Klone mit Inserts, die nicht im richtigen Leseraster kloniert waren, wurden durch den RGS·His Antikörper nicht erkannt. Ein Protokoll für die Analyse von His6-Fusionsproteinen durch matrix assisted laser ionisation/desorption Massenspektrometrie (MALDI-MS) wurde etabliert. His6-Fusionsproteine wurden auf Ni2+-Chelator-beschichteten magnetisierbaren Partikeln immobilisiert und so unter denaturierenden Bedingungen gereinigt und direkt mit Trypsin verdaut. Die Massen der tryptischen Peptide wurden gemessen und mit vorhergesagten Massen aus Sequenzdatenbanken verglichen. Die Verwendung von geordneten cDNA Expressionsbanken erweitert die Anwendung von geordneten DNA-Banken auf Protein-basierende Screening-Methoden, und schafft so eine direkte Verbindung zwischen experimentellen Daten, die auf DNA- und Proteinbasis gewonnen werden. Die hEx1 Expressionbank ermöglicht eine schelle Identifikation von Expressionsklonen für bestimmte Gene durch Screening mit DNA-Hybridisierungs-Sonden oder Antikörpern. Die Protein-Produkte von Klonen der cDNA-Bank können direkt für funktionelle Assays verwendet werden, oder können, falls inclusion bodies gebildet werden, als Antigene für die Produktion von Antikörpern verwendet oder möglicherweise in vitro gefaltet werden. Bibliotheken aus Expressionsklonen könnten, in Kombination mit Protein-Expression und -Reinigung in Mikrotiterplatten mit hohem Durchsatz, einen sinnvollen Weg zur Herstellung von Gen-Produkt-Katalogen darstellen.