Dynamische Kernpolarisation in der Festkörper-Magnetresonanzspektroskopie von Proteinen: Kann die dynamische Kernpolarisation zum strukturellen Verständnis von Membranrezeptoren beitragen?

Abstract

Die Strukturaufklärung von Proteinkomplexen oder von Membranproteinen mittels Magnetresonanzspektroskopie (NMR) ist vor allem durch die geringe Sensitivität dieser Methode limitiert. Die dynamische Kernpolarisation (DNP) kann die Intensität von NMR-Signalen um bis zu zwei Größenordnungen steigern, indem die relativ große Polarisation von ungepaarten Elektronen unter Mikrowellenanregung und bei kryogenen Temperaturen auf Kerne übertragen wird. Erfahrungen, DNP bei Proteinen anzuwenden, sind jedoch kaum vorhanden. In dieser Arbeit wird der Einfluss der einzelnen experimentellen Parameter untersucht und optimiert, mit dem Ziel auswertbare DNP-Spektren von Proteinen zu erhalten. In ersten Untersuchungen zeigte sich, dass Proteinsignale bei kryogenen Temperaturen eine starke Linienverbreiterung zeigen. Um die zugrundeliegenden Prozesse zu verstehen, wurden 2D Spektren des Proteins SH3 bei Temperaturen zwischen 295 und 95K aufgenommen und im Detail analysiert. Es zeigte sich, dass die Linienverbreiterung vor allem inhomogen ist. Das Ausmaß der Verbreiterung hängt dabei stark von der jeweiligen Seitenkette und ihrer individuellen Umgebung ab. Neben den kryogenen Temperaturen unterscheidet vor allem die Zugabe von Radikalen die DNP von konventioneller NMR. Die genutzten Biradikale verändern als Paramagneten die NMR-Parameter von Kernen in ihrer Nähe. Eine genaue Untersuchung und Quantifizierung dieser Effekte wurde mit gefrorenen Lösungen von Prolin durchgeführt. Die Radikale verkürzen die Relaxationszeiten der benachbarten Kerne. Eine schnellere T1-Relaxation der Protonen erlaubt dabei eine kürzere Messzeit, während eine schnellere T2-Relaxation der Kohlenstoffe deren NMR-Signale homogen verbreitert. In Summe führen die paramagnetischen Effekte dazu, dass Kerne in einem Abstand bis zu ungefähr 10 Angström um ein radikalisches Zentrum in der NMR nicht detektierbar sind und die optimale Konzentration an Radikalen für jede Probe unterschiedlich ist. Aufgrund der inhomogenen Signalverbreiterung bei kryogenen Temperaturen stellt sich die Frage, ob DNP-Experimente auch bei intermediären Temperaturen durchgeführt werden können, ohne die DNP- Verstärkung vollständig zu verlieren. Dazu wurden DNP-Messungen von deuteriertem SH3 bei 173K durchgeführt. Dabei beträgt der Verstärkungsfaktor der Protonen noch ca. 11 und die Auflösung der Spektren ist wesentlich besser als bei 95K. Diese Methode hat für Proben, die deuteriert werden können, in Zukunft ein großes Potenzial. Um zu untersuchen, wie sich Membranproteine mittels DNP messen lassen, wurde als Testsystem Neurotoxin II gebunden an nikotinerge Acetylcholinrezeptoren in nativen Membranen gewählt. Dabei konnte gezeigt werden, dass sich das Biradikal bevorzugt an Protein- und Membranoberflächen anlagert, wodurch die NMR-Signale des Liganden stark homogen verbreitert sind. Außerdem reagiert das Biradikal mit Probenbestandteilen und wird inaktiviert. Durch eine Lagerung bei −20 °C lässt sich dieser Effekt ausnutzen, um nur die Radikale nahe des Analyten zu inaktivieren, während im gefrorenen Lösungsmittel aktive Radikale verbleiben. Unter diesen Umständen lassen sich DNP-Signale mit einer Auflösung wie bei Rautemperatur-Messungen erhalten. So kann ohne Informationsverlust die Messzeit von zehn Tagen auf zehn Stunden reduziert werden. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, wie sich DNP-Parameter und Proben optimieren lassen, um die DNP-Spektroskopie für eine Anwendung an Proteinen weiterzuentwickeln. Zwei verschiedene Wege wurden aufgezeigt, die es erlauben, aufgelöste und DNP-verstärkte Spektren von Proteinen zu messen und in Zukunft neue strukturbiologische Antworten zu finden.

Structure determination of protein-complexes and membrane-proteins with nuclear magnetic resonance (NMR) is limited by the low sensitivity of this method. Dynamic nuclear polarization (DNP) can enhance the intensity of NMR- signals by up to two orders of magnitude due to the transfer of the large polarization of unpaired electrons to nuclei under microwave irradiation and at cryogenic temperatures. Not much is know about DNP-experiments with proteins. In this thesis, individual experimental parameters are investigated and optimized with the aim of recording resolved DNP spectra of proteins. Preliminary experiments show that protein signals broaden at cryogenic temperatures. To understand the underlying processes, two-dimensional spectra of the protein SH3 were recorded at temperatures between 295 and 95K and analyzed in detail. The line broadening was shown to be primarily inhomogeneous. The degree of broadening depends strongly on the individual sidechain and ist environment. Another difference between DNP and conventional NMR is the addition of stable radicals. Being paramagnets, the radicals change the NMR-parameters of nearby nuclei. These effects were investigated in detail and quantified with frozen solutions of proline. The radicals shorten the relaxation-times of surrounding nuclei. Faster T1-relaxation of protons allows for a shorted measurement time, whereas faster T2-relaxation of carbons homogeneously broadens their signals. In sum, the paramagnetic effects make nuclei closer than 10 angstrom to the radical undetectable with NMR and the optimal concentration of radicals is different for every sample. The observation of inhomogeneous broadening raises the question if DNP-experiments are feasible at intermediate temperatures without fully losing DNP- enhancement. To investigate this possibility, deuterated SH3 was measured at 173K. The enhancement of protons at this temperature is still ca. 11 and the resolution of the spectra is substantially better than at 95K. This method has great potential for samples that can be deuterated. To investigate how membrane proteins can be measured with DNP, a model system of neurotoxin II bound to nicotinic acetylcholinreceptors in native membranes was chosen. The experiments show that the biradical preferentially accumulates at the protein and membrane surfaces. Hence, the NMR-signals of the ligand are strongly homogeneously broadened. The biradical then reacts with components of the sample becoming inactivated. By storing the sample at −20°C, this effect can be used to inactivate the radicals close to the analyte while also keeping active radicals in the solvent. Under these conditions NMR-spectra can be measured with a resolution otherwise only observed at room temperature. In this way it is possible to decrease the measurement time from ten days to ten hours without loosing information. In summary, this work shows how to optimize the DNP-parameters and sample preparation to refine DNP-spectroscopy for the application to proteins. Two different ways are shown, which allow the recording of DNP-enhanced and resolved spectra of proteins and to find new answers to the questions of structural biology.