Heterotope Chondrozyten und dreidimensionale Ko-Kulturen für den Einsatz in der autologen Gelenkknorpelrekonstruktion

Abstract

Die Matrix assistierte autologe Chondrozyten Implantation (MACI) stellt den momentanen Goldstandard zur Behandlung großer Gelenkknorpeldefekte dar. Der therapeutische Erfolg wird durch hohe Entnahmemorbiditäten sowie die geringe Verfügbarkeit von gesundem Spendergewebe stark limitiert. Falls adulte heterotope Knorpelzellen ein belastbares hyalines Ersatzgewebe generieren könnten, bestünde hier eine vielversprechende Modifikations- möglichkeit der herkömmlichen MACI. Deshalb wurde in der vorliegenden Arbeit die vergleichende Charakterisierung artikulärer, aurikulärer und nasoseptaler Chondrozyten in zweidimensionalen (2D) und dreidimensionalen (3D) in vitro Kultursystemen sowie im in vivo Xenograft-Nacktmausmodell vorgenommen, um anschließend die Kompatibilität sowie die wechselseitige Beeinflussung heterotoper Chondrozyten in Ko-Kulturen (aurikulär/artikulär, nasoseptal/artikulär) zu untersuchen. Dabei wurden wichtige chondrogene Marker und extrazelluläre Matrix (EZM)-Bestandteile (Sox9, Aggrecan; Kollagene Typ I, II, IX, XI, Elastin, Lubricin, β1-Integrin) mittels RTD-PCR-, Western Blot-, immunzytochemischer und quantitativer Analysen nachgewiesen. Die Knorpelneogenese in den in vitro und in vivo 3D Kulturen wurde (immun-) histologisch dargestellt. In der 2D Kultur wurde der Hauptknorpelmarker Kollagen Typ II in artikulären Chondrozyten höher exprimiert. Auch im 3D-Alginatkultursystem lag die Expression des Kollagens Typ II über den gesamten Untersuchungszeitraum unterhalb des Niveaus in den artikulären Chondrozyten. Die PGA-assoziierten Kulturen zeigten eine hohe Vitalität und eine umfangreiche EZM-Produktion. Bezüglich der Kollagen Typ II Expression konnten keine signifikanten Unterschiede mehr zwischen den artikulären und den heterotopen Chondrozyten nachgewiesen werden. Die guten Kollagen Typ II/ I Ratios sprechen für eine erfolgreiche und mit artikulären Chondrozyten vergleichbare Redifferenzierung der heterotopen Chondrozyten in dem PGA-assoziierten Kultursystem. Im in vivo Xenograft-Nacktmausmodell konnte mit allen heterotopen Chondrozytenarten eine Bildung von hyalinartigem Knorpelgewebe erzielt werden. In den nasoseptalen Chondrozyten Kulturen wurde dabei eine stark ausgeprägte Ossifikation evident. Die Präsenz elastischer Fasern konnte jedoch in keiner Kultur nachgewiesen werden. Über eine Zell-Markierung wurde die Koexistenz der verschiedenen Chondrozytenarten 2D sowie 3D Ko-Kulturen bewiesen. Die in den PGA- assoziierten Ko- Kulturen im Vergleich zu den artikulären Mono-Kulturen günstigere Kollagen Typ II/ I Ratio deutet auf eine positive Wechselwirkung der heterotopen Chondrozyten hin. Die dieser Arbeit zu Grunde liegenden Daten sprechen für die weitere Verwendung heterotoper Chondrozyten, im Besonderen aurikulärer Chondrozyten, in einem experimentellen Kontext der MACI.

The Matrix assisted autolouge chondrocyte implantation (MACI) is today's gold standard for the treatment of huge articular cartilage defects. The therapeutically outcome is strongly limited by a high donor site morbidity and the small amount of available healthy articular cartilage tissue. It would be a promising approach for the common MACI, if adult heterotopic chondrocytes are able to build up a resistible hyaline replacement tissue. That`s why a major part in the present work was a comparative characterisation of articular, auricular and nasoseptal chondrocytes in two dimensional (2D) and three dimensional (3D) in vitro culture systems as well as in an in vivo xenograft nude mice model. Further the capability and interaction between heterotopic chondrocytes in couture systems (auricular/articular, nasoseptal/articular) was investigated. Their fore important chondrogenic markers and extracellular matrix (ECM)-components (sox9, aggrecan, collagen type I, II , IX, XI, elastin, lubricin, β1-integrin ) was analysed by RTD- PCR, western bloting, immuncytochemical and quantitative ECM measurement. The cartilage neogenesis of in vitro and in vivo cultures was visualised via (immune-) histological technics. In the 2D cultures as well as in the 3D alginate culture system the major cartilage marker collagen type II was upmost expressed in articular chondrocytes. During the whole investigation time the PGA-Scaffold associated cultures shows high vitality and an extensive ECM- Production. Concerning the collagen type II expression no significant differences was found between the heterotopic chondrocytes. The good collagen type II / type I ratio allude to a successful redifferentiation of the heterotopic chondrocytes in the PGA-Scaffold associated culture system comparable to those of the articular ones. During the in vivo xenograft nude mice experiments a hyaline like cartilage tissue was produced by al heterotopic chondrocyte cultures. Thereby a makeable ossification was evident especially in the nasoseptal chondrocyte cultures. Further no elastic fibres could be detected in al type of cultures. Due to cell tracking technics the coexistence of both heterotopic chondrocyte types was proven in the used 2D and 3D co-culture systems. The collagen type II / type I ratio was more favourable in co-cultures than in articular mono-cultures which indicates a positive and mutual interplay of the heterotopic chondrocytes. The finding of this work together argues for further investigation of heterotopic chondrocytes, especially auricular chondrocytes, for MACI in an experimental context.