Interactions of smads and WW domains of proteins involved in TGF-ß signalling

Abstract

Smad proteins are the mediators of the TGF-ß signalling pathway that controls cell growth and specific cell differentiations. Defects in this pathway can lead to rapid cell growth resulting in cancer diseases. In response to TGF-ß signalling, Smad2 and 3 are activated and transferred with the help of Smad4 to the nucleus, where they regulate the transcription of target genes. The inhibitor Smad7 can negatively regulate the TGF-ß pathway by triggering TGF ß receptor I degradation. Smad proteins interact with other proteins through their linker region, which connects the DNA binding domain named MH1 with a TGF-ß-receptor-binding domain known as MH2 domain. The Smad2/3 linker region consists of several (S/T)P motifs that can be phosphorylated by different kinases. The Smad7 linker region is not phosphorylated but contains as Smad2 and 3 a PPxY (PY) motif that is recognized by WW domains. WW domains are small binding domains present in around 170 proteins of variable function involved in many cellular processes including transcription, splicing or protein degradation among others. In the main part of this work the interactions of R-Smad3 with the proteins Nedd4L and Pin1 were studied to understand the role of the Smad3 linker phosphorylation and its influence on WW domain binding. In the second part the interactions of the inhibitor Smad7 and the proteins Nedd4L and TAZ were characterized to obtain more information about their role in TGF-ß inhibition. In both parts the aim was to understand how specificity can be achieved by the WW domains. The structures of six WW domain - Smad complexes were solved and similarities and differences were pointed out. At the start the interaction of Nedd4L and the phosphorylated Smad2/3 linker, which leads to Smad2/3 degradation, has been studied. Using isothermal titration calorimetry (ITC) and nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR) it could be shown that of all four Nedd4L WW domains the second domain binds to the phosphorylated Smad2/3 pT[PY] motif with the highest affinity. The NMR structure of the Nedd4L WW2 – Smad3 pT[PY] complex revealed that the PPPxY site of the ligand is bound with all proline residues in trans configuration and the tyrosine residue accommodated in the second loop of the WW domain. The novelty of the complex resides in the binding of the phosphate group, which is specifically recognized by amino acids K378 and R380 in the first loop region. This new interaction has been corroborated by Nedd4L WW2 point mutations and by 31P-NMR titration experiments. Furthermore, the binding of the phosphorylated Smad3 linker to the WW domain of the peptidyl-prolyl isomerase Pin1 has been studied. Pin1 catalyses the cis-trans isomerisation of prolines specifically preceded by phosphorylated serines or threonines. The KD values obtained by ITC binding studies showed that the Pin1 WW domain strongly interacts with the Smad3 pT179P motif while bindings to the bi-phosphorylated Smad3 pS204P-pS208P and pS208P-pS213P peptides are weaker or barely observable as in the case of the monophosphorylated Smad3 pS204P peptide. To understand these differences in the binding affinities the structure of the Pin1 WW - Smad3 pT179P complex and of the Pin1 WW - Smad3 pS208P-pS213P complex was solved by solution NMR. It could be shown that in both complexes only one p(S/T)P motif is bound, also in trans-configuration, by the Pin1 WW domain involving amino acids of the first ß-stand and that the affinity is enhanced through the presence of a negatively charged amino acid at position x-1 and of a proline at position x-2 of the p(S/T)P motif. The influence of the phosphate group on binding the Pin1 WW domain was pointed out by 31P titrations. When compared to the Nedd4L WW2 recognition of the Smad3 pT179[PY] motif the Pin1 WW - Smad3 pT179P complex reveals a different binding mode. On the one hand the phosphate group is bound at different locations within the domains on the other hand the peptide is bound from the N- to C-terminus by the Pin1 WW domain and in opposite direction from the C- to N-terminus by the Nedd4L WW2 domain. The different modes of Smad3 recognition may reflect the different outcomes of these two interactions. ITC measurements of Nedd4L WW2 and Smad3 pT179[PY] as well as of Pin1 WW and Smad3 pS208P-pS213P at different proton concentrations revealed that in both cases the binding affinity increases with the pH values. The highest affinity was observed at pH 8.0. This information was used to optimize the conditions for the NMR experiments, but could also play a role in the regulation of protein binding in the physiological environment of the cell. In order to understand the role of the other WW domains present in Nedd4L, Smad3 fragments including the PY motif and other pSP sites were titrated with the three possible Nedd4L WW pairs. Of the three consecutive pairs present in Nedd4L, only the WW2-WW3 pair showed high affinity for the extended Smad3 sequence. However, the determination of the structure of the Nedd4L WW2-WW3 module in solution bound to the Smad3 linker peptide pT[PY]-pS-pS (Smad3 176-211 segment tri-phosphorylated at T179, S204 and S208) posed a challenge owing to the complexity introduced by the poor NMR signal dispersion of the 80 amino acid region connecting WW2 and WW3 domains. To simplify the interpretation of the NMR data, the WW2-WW3 module was prepared as two separate fragments, which allowed the use of sequential isotope labelling. A disulfide-bond protein ligation strategy was applied to connect these two fragments. Using a stepwise assignment approach the complex structure with the Smad3 176-211 segment was studied in detail. In the second part of this work the question was raised how inhibitor Smad7 is recognized by the WW domain containing proteins Nedd4L and TAZ. Smad7 recruits Nedd4L for TGF-ß receptor I degradation in the cytoplasm while the interaction with TAZ mainly occurs in the nucleus. Through ITC binding studies of the individual Nedd4L WW domains and a 15 amino acid Smad7 linker peptide containing the PY motif it could be shown that the second WW domain is the preferred Smad7 binding domain. Solution NMR based structure determination of the Nedd4L WW2 domain bound to the Smad7[PY] peptide revealed that the high affinity is due to additional contacts of the C-terminal part of Smad7 and the ß1 sheet region of the Nedd4L WW2 domain and electrostatic interactions of the Smad7 N-terminus and the loop 1 region of the domain. Further it could be shown by ITC experiments that this affinity is not enhanced by the presence of additional Nedd4L WW domains. The co-factors YAP and its paralogue TAZ consist of two (YAP) and one (TAZ) WW domain(s) and have also been reported to interact with Smads. However, the interaction between YAP and Smad7 results in enhanced TGF-ß receptor degradation whereas binding of TAZ and Smad7 has not been studied yet. The sequence alignment of the WW domains of TAZ and YAP reveals a higher sequence identity between YAP WW1 and TAZ WW than between the YAP WW1 and WW2 domains. ITC experiments carried out in this thesis revealed that the first WW domain in YAP binds the 15 amino acid Smad7 peptide with a higher affinity than the second WW domain and equally well as TAZ WW. Structures of the YAP WW1 domain bound to PY motifs have been previously described but in this work the first structure for the WW domain of the human TAZ bound to a PY ligand was determined. The TAZ WW - Smad7[PY] complex is very similar to its Nedd4L WW2 counterpart in the PY motif-containing region and in the C-terminal extension, but differ in the way in which the Smad7 N-terminus is recognized. As a conclusion, the findings presented in this work expand the known structural and functional versatility of WW domains as protein-protein interaction modules. Further this work shows that the interaction of Nedd4L and Pin1 with Smad3 is regulated by linker phosphorylation up- and downstream of the PY motif, which is carried out by special kinases in a precise order. Nedd4L binds to the Smad3 pT[PY] motif and two additional phosphorylation sites within Smad3 linker. The Pin1 WW domain only requires the Smad3 pTP motif with a single phosphorylation site for binding, which probably acts as the anchoring place for the prolyl-isomerase protein. Thus, Pin1 WW may be able to participate in the regulation of Smad3 as an active player of the Smad3 and Nedd4L interaction. Further, Nedd4L achieves high specificity by binding Smad3 following a two-step cooperative mode that involves the two vicinal domains WW2 and WW3. This ability of WW domains to recognize both pT[PY] and pS-pS motifs was previously unknown. The interaction of Nedd4L and Smad7 results in inhibition of the TGF-ß pathway through TGF-ß receptor I degradation. In this work it could be demonstrated that the single Nedd4L WW2 domain is sufficient to interact with the Smad7[PY] motif with high affinity. The individual WW domain of the adaptor protein TAZ also interacts with the inhibitor Smad but slightly weaker. Both complexes are very similar in the region containing the PY motif and also the C-terminal extension but they differ in the recognition of the N-term site by the domain. These differences may reflect the distinct functional outcomes of the two interactions. TAZ was previously known as a TGF-ß signalling agonist but in this work it is shown that TAZ also can play an inhibitory role in TGF-ß signalling as reported for its paralogue YAP.

Smad Proteine sind Signalüberträger innerhalb des TGF-ß Signalweges, welcher das Zellwachstum und die Zelldifferenzierung kontrolliert. Fehler innerhalb dieses Signalweges können zu schnellem Zellwachstum und damit zu Krebs führen. Durch die TGF-ß Signale werden Smad2 and 3 aktiviert und mit Hilfe von Smad4 in den Zellkern transportiert, wo sie die Gentranskription bestimmter Gene regulieren. Inhibitor-Smad7 kann durch den Abbau des TGF-ß Rezeptors I den TGF-ß Signalweg negativ beeinflussen. Smad Proteine wechselwirken mit anderen Proteinen über eine Linker-Region, welche die DNA-bindende MH1 Domäne mit der TGF ß Rezeptor-bindenden MH2 Domäne verbindet. Innerhalb des Smad2/3-Linkers befinden sich mehrere (S/T)P Motive, welche von verschiedenen Kinasen phosphoryliert werden können. Der Smad7-Linker wird nicht phosphoryliert, enthält jedoch wie Smad2 und 3 ein PPxY (PY) Motiv, das von WW Domänen erkannt wird. WW Domänen sind kleine Bindungsdomänen, die in ca. 170 Proteinen verschiedener Funktionen identifiziert wurden und an vielen Zellprozessen beteiligt sind, wie unter anderem der Transkription, dem Spleißen oder dem Proteinabbau. Im Hauptteil dieser Arbeit wurde die Wechselwirkung zwischen R-Smad3 und den Proteinen Nedd4L und Pin1 untersucht, um die Bedeutung der Smad3-Linker Phosphorylierung und deren Einfluss auf die Bindung zu WW Domänen zu verstehen. Im zweiten Teil wurde die Bindung zwischen dem Inhibitor-Smad7 und den Proteinen Nedd4L und TAZ charakterisiert, um unsere Kenntnis über deren inhibitorische Funktion innerhalb des TGF-ß Signalweges zu erweitern. Das Ziel in beiden Teilen war es zu verstehen, wie Spezifität von den WW Domänen erreicht werden kann. Die Strukturen von sechs Komplexen aus WW Domänen und Smads wurden gelöst und Gemeinsamkeiten und Unterschiede aufgezeigt. Zunächst wurde die Bindung zwischen Nedd4L und dem phosphorylierten Smad2/3-Linker untersucht, welche den Smad2/3 Abbau zur Folge hat. Mittels Isothermer Titrationskalorimetrie (ITC) und Kernspinresonanzspektroskopie (NMR) konnte gezeigt werden, dass von allen vier Nedd4L WW Domänen die zweite Domäne das phosphorylierte Smad2/3 pT[PY] Motiv am stärksten bindet. Die NMR Struktur des Nedd4L WW2 – Smad3 pT[PY] Komplexes zeigte, dass alle Prolinreste des PPPxY Teils des Liganden in trans- Konfiguration vorliegen und, dass der Smad3 Tyrosinrest von WW2 Aminosäuren in der Nähe der zweiten Schleife gebunden wird. Die Besonderheit dieses Komplexes ist die Wechselwirkung mit der Phosphatgruppe, welche von den Aminosäuren K378 und R380 innerhalb der ersten Schleife gebunden wird. Diese neue Art der Bindung konnte durch Punktmutationen innerhalb der Nedd4L WW2 Domäne und durch 31P-NMR-Titrationsexperimente bestätigt werden. Des Weiteren wurde die Bindung zwischen dem phosphorylierten Smad3-Linker und der WW Domäne der Peptidyl- Prolyl-Isomerase Pin1 untersucht. Pin1 katalysiert die cis-trans Isomerisierung von Prolinen, denen ein phosphoryliertes Serin oder Threonin in der Sequenz vorangeht. Bindungsstudien mittels ITC zeigten, dass die Pin1 WW Domäne das Smad3 pT179P Motiv am stärksten bindet während Bindungen zu dem zweifach phosphorylierten Smad3 pS204P-pS208P und pS208P-pS213P Peptiden schwächer oder wie im Fall des monophosphorylierten pS204P Peptids kaum zu beobachten waren. Um die unterschiedlichen Bindungsstärken zu verstehen, wurden die Strukturen des Pin1 WW – Smad3 pT179P und des Pin1 WW – Smad3 pS208P-pS213P Komplexes mittels NMR gelöst. Es konnte gezeigt werden, dass in beiden Komplexen nur ein p(S/T)P Motiv, ebenfalls in trans-Konfiguration, von der Pin1 WW Domäne gebunden wird, wobei Aminosäuren des ersten ß-Stranges an der Bindung der Phosphatgruppe beteiligt sind. Des Weiteren wurde gezeigt, dass die Bindung verstärkt wird durch negativ geladene Aminosäuren in Position x-1 sowie durch die Anwesenheit eines Prolinrestes in Position x-2 ausgehend vom p(S/T)P Motiv. Der Einfluss der Phosphatgruppe auf die Bindung wurde mittels 31P-Titration verdeutlicht. Im Vergleich zum Nedd4L WW2 – Smad3 pT[PY] Komplex ist ein anderer Bindungsmodus im Falle der Pin1 WW – Smad3 pTP Wechselwirkung zu erkennen. Zum einen wird die Phosphatgruppe an unterschiedlichen Stellen von den Domänen gebunden, zum anderen wird das Peptid von der Pin1 WW Domäne vom N- zum C-Terminus gebunden und in umgekehrter Richtung vom C- zum N-Terminus von Nedd4L WW2. Diese strukturellen Unterschiede im Bindungsmodus könnten die verschiedenen Funktionen der beiden Wechselwirkungen widerspiegeln. ITC Messungen der Nedd4L WW2 – Smad3 pT179[PY] Wechselwirkung als auch der Pin1 WW – Smad3 pS208P-pS213P Bindung bei unterschiedlichen Protonenkonzentrationen zeigten, dass in beiden Fällen die Bindungsstärke mit dem pH Wert steigt. Die höchste Affinität wurde für pH 8.0 ermittelt. Diese Information wurde zur Optimierung der NMR-Experimente genutzt, kann aber auch eine Rolle bei der Regulierung von Protein-Protein Wechselwirkungen in der physiologischen Umgebung der Zelle spielen. Um die Funktion der übrigen WW Domänen in Nedd4L zu verstehen, wurden Smad3 Fragmente mit dem PY Motiv und weiteren pSP Seiten zu den drei möglichen Nedd4L WW Paaren titriert. Von den drei aufeinanderfolgenden WW Paaren in Nedd4L, zeigte lediglich das WW2-WW3 Paar eine hohe Affinität zum Smad3-Linker (Smad3 176-211 Segment dreifach phosphoryliert in Position T179, S204 und S208). Die Strukturbestimmung des Nedd4L WW2-WW3 – Smad3 pT[PY]-pS-pS Komplexes stellte aufgrund der schlechten NMR-Signaldispersion der 80-Aminosäure-Region, welche die WW2 und die WW3 Domänen miteinander verbindet, eine große Herausforderung dar. Um die Interpretation der NMR Daten zu vereinfachen, wurde das WW2-WW3 Paar in zwei getrennten Fragmenten hergestellt, wodurch eine sequenzielle Isotopenmarkierung ermöglicht wurde. Mittels chemischer Ligation wurden die beiden Fragmente durch eine Disulfidbrücke miteinander verbunden. Mit diesem schrittweisen Ansatz konnte die Struktur des Nedd4L WW2-WW3 – Smad3 Komplexes im Detail untersucht werden. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Frage aufgeworfen wie der Inhibitor-Smad7 durch die WW Domänen der Proteine Nedd4L und TAZ erkannt wird. Im Zytoplasma bindet Smad7 mit Nedd4L und bewirkt den Abbau des TGF-ß Rezeptor I während TAZ hauptsächlich im Zellkern vorhanden ist. ITC Bindungsstudien der individuellen Nedd4L WW Domänen und einem Smad7-Linker Peptid aus 15 Aminosäuren inklusive dem PY Motiv zeigten, dass die zweite WW Domänen die bevorzugte Smad7 Bindungsdomäne ist. Die hohe Bindungsstärke wird von zusätzlichen Kontakten des Smad7 C-Terminus und der ß1-Strangregion der Nedd4L WW2 Domäne hervorgerufen, sowie durch elektrostatische Wechselwirkungen des Smad7 N-Terminus und der ersten Schleife der WW2 Domäne. Dies konnte mittels NMR basierende Strukturanalyse des Nedd4L WW2 – Smad7[PY] Komplexes verdeutlicht werden. Darüber hinaus zeigten ITC Experimente, dass die Bindung durch die Präsenz weiterer Nedd4L WW Domänen nicht verstärkt wird. Der Co-Faktor YAP und sein Paralog TAZ besitzen zwei (YAP) und eine (TAZ) WW Domäne(n) und wurden ebenfalls als Smad Bindungspartner beschrieben. Die Bindung zwischen YAP und Smad7 führt zu verstärktem TGF-ß Rezeptor I Abbau, während die Wechselwirkung zwischen TAZ und Smad7 bisher noch nicht untersucht wurde. Eine Sequenzanilierung der YAP und TAZ WW Domänen zeigt eine höhere Sequenzidentität zwischen YAP WW1 und TAZ WW als zwischen den beiden YAP Domänen. In dieser Arbeit konnte durch ITC Experimente gezeigt werden, dass die YAP WW1 Domäne das Smad7 Linkerpeptid stärker bindet als die WW2 Domäne und zwar mit einer ähnlichen Bindungsstärke wie sie zwischen der TAZ WW Domäne und Smad7 ermittelt wurde. Strukturen der YAP WW1 Domäne im Komplex mit PY Motiven wurden bereits in der Literatur mehrfach beschrieben allerdings ist dies das erste Mal, dass die Struktur einer WW Domäne des humanen TAZ Proteins mittels NMR bestimmt wurde. Im Vergleich mit Nedd4L binden sowohl TAZ WW als auch Nedd4L WW2 das Smad7 PY Motiv und den verlängerten C-Terminus sehr ähnlich jedoch sind Unterschiede in der Wechselwirkung mit dem Smad7 N-Terminus zu erkennen. Zusammenfassend erweitern die in dieser Arbeit präsentierten Ergebnisse unser Wissen über die strukturelle und funktionelle Vielseitigkeit der WW Domänen als Protein- Protein Wechselwirkungsmodule. Darüber hinaus zeigt diese Arbeit, dass Smad3-Linker Phosphorylierung, welche von verschiedenen Kinasen in einer bestimmten Reihenfolge durchgeführt wird, die Interaktion mit Nedd4L und Pin1 reguliert. Nedd4L bindet das Smad3 pT[PY] Motiv und zwei weitere Phosphorylierungsstellen innerhalb des Smad3-Linkers. Die Pin1 WW Domäne benötigt lediglich eine Phosphorylierungsstelle, welche möglicherweise als Anker für die Prolyl-Isomerase dient. Pin1 WW Domäne könnte daher an der Smad3 Regulierung beteiligt sein und die Nedd4L – Smad3 Wechselwirkung durch cis- trans Isomerierung des Smad3-Linkers beeinflussen. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass Nedd4L durch einen kooperativen, zwei Stufen Modus der benachbarten Domänen WW2 und WW3 eine hohe Bindungsspezifität gegenüber Smad3 erreicht. Diese Fähigkeit der WW Domänen sowohl pT[PY] als auch pS-pS Motive zu erkennen war bislang unbekannt. Die Bindung zwischen Nedd4L und Smad7 führt zur TGF-ß Inhibierung durch den Abbau des TGF-ß Rezeptors I. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die zweite Nedd4L WW Domäne ausreicht, um das Smad7[PY] Motiv mit hoher Affinität zu binden. Die WW Domäne des Adapter- Proteins TAZ interagiert ebenfalls mit dem Inhibitor-Smad7 aber mit einer etwas schwächeren Affinität. In beiden Komplexen ist die Bindung des PY Motivs und der C-terminalen Verlängerung sehr ähnlich, sie unterscheiden sich jedoch in der Erkennung des Smad7 N-Terminus. Diese Differenzen könnten die unterschiedlichen Funktionen der beiden Wechselwirkungen widerspiegeln. TAZ war bisher als TGF-ß Agonist bekannt, in dieser Arbeit konnte jedoch gezeigt werden, dass TAZ auch eine hemmende Funktion im TGF-ß Signalweg einnehmen kann wie bereits für seine Paralog YAP berichtet wurde.