dc.contributor.author
Görner, Nina
dc.date.accessioned
2018-06-07T22:22:09Z
dc.date.available
2012-03-13T09:47:59.309Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/9184
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-13383
dc.description.abstract
Smad proteins are the mediators of the TGF-ß signalling pathway that controls
cell growth and specific cell differentiations. Defects in this pathway can
lead to rapid cell growth resulting in cancer diseases. In response to TGF-ß
signalling, Smad2 and 3 are activated and transferred with the help of Smad4
to the nucleus, where they regulate the transcription of target genes. The
inhibitor Smad7 can negatively regulate the TGF-ß pathway by triggering TGF ß
receptor I degradation. Smad proteins interact with other proteins through
their linker region, which connects the DNA binding domain named MH1 with a
TGF-ß-receptor-binding domain known as MH2 domain. The Smad2/3 linker region
consists of several (S/T)P motifs that can be phosphorylated by different
kinases. The Smad7 linker region is not phosphorylated but contains as Smad2
and 3 a PPxY (PY) motif that is recognized by WW domains. WW domains are small
binding domains present in around 170 proteins of variable function involved
in many cellular processes including transcription, splicing or protein
degradation among others. In the main part of this work the interactions of
R-Smad3 with the proteins Nedd4L and Pin1 were studied to understand the role
of the Smad3 linker phosphorylation and its influence on WW domain binding. In
the second part the interactions of the inhibitor Smad7 and the proteins
Nedd4L and TAZ were characterized to obtain more information about their role
in TGF-ß inhibition. In both parts the aim was to understand how specificity
can be achieved by the WW domains. The structures of six WW domain - Smad
complexes were solved and similarities and differences were pointed out. At
the start the interaction of Nedd4L and the phosphorylated Smad2/3 linker,
which leads to Smad2/3 degradation, has been studied. Using isothermal
titration calorimetry (ITC) and nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR)
it could be shown that of all four Nedd4L WW domains the second domain binds
to the phosphorylated Smad2/3 pT[PY] motif with the highest affinity. The NMR
structure of the Nedd4L WW2 – Smad3 pT[PY] complex revealed that the PPPxY
site of the ligand is bound with all proline residues in trans configuration
and the tyrosine residue accommodated in the second loop of the WW domain. The
novelty of the complex resides in the binding of the phosphate group, which is
specifically recognized by amino acids K378 and R380 in the first loop region.
This new interaction has been corroborated by Nedd4L WW2 point mutations and
by 31P-NMR titration experiments. Furthermore, the binding of the
phosphorylated Smad3 linker to the WW domain of the peptidyl-prolyl isomerase
Pin1 has been studied. Pin1 catalyses the cis-trans isomerisation of prolines
specifically preceded by phosphorylated serines or threonines. The KD values
obtained by ITC binding studies showed that the Pin1 WW domain strongly
interacts with the Smad3 pT179P motif while bindings to the bi-phosphorylated
Smad3 pS204P-pS208P and pS208P-pS213P peptides are weaker or barely observable
as in the case of the monophosphorylated Smad3 pS204P peptide. To understand
these differences in the binding affinities the structure of the Pin1 WW -
Smad3 pT179P complex and of the Pin1 WW - Smad3 pS208P-pS213P complex was
solved by solution NMR. It could be shown that in both complexes only one
p(S/T)P motif is bound, also in trans-configuration, by the Pin1 WW domain
involving amino acids of the first ß-stand and that the affinity is enhanced
through the presence of a negatively charged amino acid at position x-1 and of
a proline at position x-2 of the p(S/T)P motif. The influence of the phosphate
group on binding the Pin1 WW domain was pointed out by 31P titrations. When
compared to the Nedd4L WW2 recognition of the Smad3 pT179[PY] motif the Pin1
WW - Smad3 pT179P complex reveals a different binding mode. On the one hand
the phosphate group is bound at different locations within the domains on the
other hand the peptide is bound from the N- to C-terminus by the Pin1 WW
domain and in opposite direction from the C- to N-terminus by the Nedd4L WW2
domain. The different modes of Smad3 recognition may reflect the different
outcomes of these two interactions. ITC measurements of Nedd4L WW2 and Smad3
pT179[PY] as well as of Pin1 WW and Smad3 pS208P-pS213P at different proton
concentrations revealed that in both cases the binding affinity increases with
the pH values. The highest affinity was observed at pH 8.0. This information
was used to optimize the conditions for the NMR experiments, but could also
play a role in the regulation of protein binding in the physiological
environment of the cell. In order to understand the role of the other WW
domains present in Nedd4L, Smad3 fragments including the PY motif and other
pSP sites were titrated with the three possible Nedd4L WW pairs. Of the three
consecutive pairs present in Nedd4L, only the WW2-WW3 pair showed high
affinity for the extended Smad3 sequence. However, the determination of the
structure of the Nedd4L WW2-WW3 module in solution bound to the Smad3 linker
peptide pT[PY]-pS-pS (Smad3 176-211 segment tri-phosphorylated at T179, S204
and S208) posed a challenge owing to the complexity introduced by the poor NMR
signal dispersion of the 80 amino acid region connecting WW2 and WW3 domains.
To simplify the interpretation of the NMR data, the WW2-WW3 module was
prepared as two separate fragments, which allowed the use of sequential
isotope labelling. A disulfide-bond protein ligation strategy was applied to
connect these two fragments. Using a stepwise assignment approach the complex
structure with the Smad3 176-211 segment was studied in detail. In the second
part of this work the question was raised how inhibitor Smad7 is recognized by
the WW domain containing proteins Nedd4L and TAZ. Smad7 recruits Nedd4L for
TGF-ß receptor I degradation in the cytoplasm while the interaction with TAZ
mainly occurs in the nucleus. Through ITC binding studies of the individual
Nedd4L WW domains and a 15 amino acid Smad7 linker peptide containing the PY
motif it could be shown that the second WW domain is the preferred Smad7
binding domain. Solution NMR based structure determination of the Nedd4L WW2
domain bound to the Smad7[PY] peptide revealed that the high affinity is due
to additional contacts of the C-terminal part of Smad7 and the ß1 sheet region
of the Nedd4L WW2 domain and electrostatic interactions of the Smad7
N-terminus and the loop 1 region of the domain. Further it could be shown by
ITC experiments that this affinity is not enhanced by the presence of
additional Nedd4L WW domains. The co-factors YAP and its paralogue TAZ consist
of two (YAP) and one (TAZ) WW domain(s) and have also been reported to
interact with Smads. However, the interaction between YAP and Smad7 results in
enhanced TGF-ß receptor degradation whereas binding of TAZ and Smad7 has not
been studied yet. The sequence alignment of the WW domains of TAZ and YAP
reveals a higher sequence identity between YAP WW1 and TAZ WW than between the
YAP WW1 and WW2 domains. ITC experiments carried out in this thesis revealed
that the first WW domain in YAP binds the 15 amino acid Smad7 peptide with a
higher affinity than the second WW domain and equally well as TAZ WW.
Structures of the YAP WW1 domain bound to PY motifs have been previously
described but in this work the first structure for the WW domain of the human
TAZ bound to a PY ligand was determined. The TAZ WW - Smad7[PY] complex is
very similar to its Nedd4L WW2 counterpart in the PY motif-containing region
and in the C-terminal extension, but differ in the way in which the Smad7
N-terminus is recognized. As a conclusion, the findings presented in this work
expand the known structural and functional versatility of WW domains as
protein-protein interaction modules. Further this work shows that the
interaction of Nedd4L and Pin1 with Smad3 is regulated by linker
phosphorylation up- and downstream of the PY motif, which is carried out by
special kinases in a precise order. Nedd4L binds to the Smad3 pT[PY] motif and
two additional phosphorylation sites within Smad3 linker. The Pin1 WW domain
only requires the Smad3 pTP motif with a single phosphorylation site for
binding, which probably acts as the anchoring place for the prolyl-isomerase
protein. Thus, Pin1 WW may be able to participate in the regulation of Smad3
as an active player of the Smad3 and Nedd4L interaction. Further, Nedd4L
achieves high specificity by binding Smad3 following a two-step cooperative
mode that involves the two vicinal domains WW2 and WW3. This ability of WW
domains to recognize both pT[PY] and pS-pS motifs was previously unknown. The
interaction of Nedd4L and Smad7 results in inhibition of the TGF-ß pathway
through TGF-ß receptor I degradation. In this work it could be demonstrated
that the single Nedd4L WW2 domain is sufficient to interact with the Smad7[PY]
motif with high affinity. The individual WW domain of the adaptor protein TAZ
also interacts with the inhibitor Smad but slightly weaker. Both complexes are
very similar in the region containing the PY motif and also the C-terminal
extension but they differ in the recognition of the N-term site by the domain.
These differences may reflect the distinct functional outcomes of the two
interactions. TAZ was previously known as a TGF-ß signalling agonist but in
this work it is shown that TAZ also can play an inhibitory role in TGF-ß
signalling as reported for its paralogue YAP.
de
dc.description.abstract
Smad Proteine sind Signalüberträger innerhalb des TGF-ß Signalweges, welcher
das Zellwachstum und die Zelldifferenzierung kontrolliert. Fehler innerhalb
dieses Signalweges können zu schnellem Zellwachstum und damit zu Krebs führen.
Durch die TGF-ß Signale werden Smad2 and 3 aktiviert und mit Hilfe von Smad4
in den Zellkern transportiert, wo sie die Gentranskription bestimmter Gene
regulieren. Inhibitor-Smad7 kann durch den Abbau des TGF-ß Rezeptors I den
TGF-ß Signalweg negativ beeinflussen. Smad Proteine wechselwirken mit anderen
Proteinen über eine Linker-Region, welche die DNA-bindende MH1 Domäne mit der
TGF ß Rezeptor-bindenden MH2 Domäne verbindet. Innerhalb des Smad2/3-Linkers
befinden sich mehrere (S/T)P Motive, welche von verschiedenen Kinasen
phosphoryliert werden können. Der Smad7-Linker wird nicht phosphoryliert,
enthält jedoch wie Smad2 und 3 ein PPxY (PY) Motiv, das von WW Domänen erkannt
wird. WW Domänen sind kleine Bindungsdomänen, die in ca. 170 Proteinen
verschiedener Funktionen identifiziert wurden und an vielen Zellprozessen
beteiligt sind, wie unter anderem der Transkription, dem Spleißen oder dem
Proteinabbau. Im Hauptteil dieser Arbeit wurde die Wechselwirkung zwischen
R-Smad3 und den Proteinen Nedd4L und Pin1 untersucht, um die Bedeutung der
Smad3-Linker Phosphorylierung und deren Einfluss auf die Bindung zu WW Domänen
zu verstehen. Im zweiten Teil wurde die Bindung zwischen dem Inhibitor-Smad7
und den Proteinen Nedd4L und TAZ charakterisiert, um unsere Kenntnis über
deren inhibitorische Funktion innerhalb des TGF-ß Signalweges zu erweitern.
Das Ziel in beiden Teilen war es zu verstehen, wie Spezifität von den WW
Domänen erreicht werden kann. Die Strukturen von sechs Komplexen aus WW
Domänen und Smads wurden gelöst und Gemeinsamkeiten und Unterschiede
aufgezeigt. Zunächst wurde die Bindung zwischen Nedd4L und dem
phosphorylierten Smad2/3-Linker untersucht, welche den Smad2/3 Abbau zur Folge
hat. Mittels Isothermer Titrationskalorimetrie (ITC) und
Kernspinresonanzspektroskopie (NMR) konnte gezeigt werden, dass von allen vier
Nedd4L WW Domänen die zweite Domäne das phosphorylierte Smad2/3 pT[PY] Motiv
am stärksten bindet. Die NMR Struktur des Nedd4L WW2 – Smad3 pT[PY] Komplexes
zeigte, dass alle Prolinreste des PPPxY Teils des Liganden in trans-
Konfiguration vorliegen und, dass der Smad3 Tyrosinrest von WW2 Aminosäuren in
der Nähe der zweiten Schleife gebunden wird. Die Besonderheit dieses Komplexes
ist die Wechselwirkung mit der Phosphatgruppe, welche von den Aminosäuren K378
und R380 innerhalb der ersten Schleife gebunden wird. Diese neue Art der
Bindung konnte durch Punktmutationen innerhalb der Nedd4L WW2 Domäne und durch
31P-NMR-Titrationsexperimente bestätigt werden. Des Weiteren wurde die Bindung
zwischen dem phosphorylierten Smad3-Linker und der WW Domäne der Peptidyl-
Prolyl-Isomerase Pin1 untersucht. Pin1 katalysiert die cis-trans
Isomerisierung von Prolinen, denen ein phosphoryliertes Serin oder Threonin in
der Sequenz vorangeht. Bindungsstudien mittels ITC zeigten, dass die Pin1 WW
Domäne das Smad3 pT179P Motiv am stärksten bindet während Bindungen zu dem
zweifach phosphorylierten Smad3 pS204P-pS208P und pS208P-pS213P Peptiden
schwächer oder wie im Fall des monophosphorylierten pS204P Peptids kaum zu
beobachten waren. Um die unterschiedlichen Bindungsstärken zu verstehen,
wurden die Strukturen des Pin1 WW – Smad3 pT179P und des Pin1 WW – Smad3
pS208P-pS213P Komplexes mittels NMR gelöst. Es konnte gezeigt werden, dass in
beiden Komplexen nur ein p(S/T)P Motiv, ebenfalls in trans-Konfiguration, von
der Pin1 WW Domäne gebunden wird, wobei Aminosäuren des ersten ß-Stranges an
der Bindung der Phosphatgruppe beteiligt sind. Des Weiteren wurde gezeigt,
dass die Bindung verstärkt wird durch negativ geladene Aminosäuren in Position
x-1 sowie durch die Anwesenheit eines Prolinrestes in Position x-2 ausgehend
vom p(S/T)P Motiv. Der Einfluss der Phosphatgruppe auf die Bindung wurde
mittels 31P-Titration verdeutlicht. Im Vergleich zum Nedd4L WW2 – Smad3 pT[PY]
Komplex ist ein anderer Bindungsmodus im Falle der Pin1 WW – Smad3 pTP
Wechselwirkung zu erkennen. Zum einen wird die Phosphatgruppe an
unterschiedlichen Stellen von den Domänen gebunden, zum anderen wird das
Peptid von der Pin1 WW Domäne vom N- zum C-Terminus gebunden und in
umgekehrter Richtung vom C- zum N-Terminus von Nedd4L WW2. Diese strukturellen
Unterschiede im Bindungsmodus könnten die verschiedenen Funktionen der beiden
Wechselwirkungen widerspiegeln. ITC Messungen der Nedd4L WW2 – Smad3 pT179[PY]
Wechselwirkung als auch der Pin1 WW – Smad3 pS208P-pS213P Bindung bei
unterschiedlichen Protonenkonzentrationen zeigten, dass in beiden Fällen die
Bindungsstärke mit dem pH Wert steigt. Die höchste Affinität wurde für pH 8.0
ermittelt. Diese Information wurde zur Optimierung der NMR-Experimente
genutzt, kann aber auch eine Rolle bei der Regulierung von Protein-Protein
Wechselwirkungen in der physiologischen Umgebung der Zelle spielen. Um die
Funktion der übrigen WW Domänen in Nedd4L zu verstehen, wurden Smad3 Fragmente
mit dem PY Motiv und weiteren pSP Seiten zu den drei möglichen Nedd4L WW
Paaren titriert. Von den drei aufeinanderfolgenden WW Paaren in Nedd4L, zeigte
lediglich das WW2-WW3 Paar eine hohe Affinität zum Smad3-Linker (Smad3 176-211
Segment dreifach phosphoryliert in Position T179, S204 und S208). Die
Strukturbestimmung des Nedd4L WW2-WW3 – Smad3 pT[PY]-pS-pS Komplexes stellte
aufgrund der schlechten NMR-Signaldispersion der 80-Aminosäure-Region, welche
die WW2 und die WW3 Domänen miteinander verbindet, eine große Herausforderung
dar. Um die Interpretation der NMR Daten zu vereinfachen, wurde das WW2-WW3
Paar in zwei getrennten Fragmenten hergestellt, wodurch eine sequenzielle
Isotopenmarkierung ermöglicht wurde. Mittels chemischer Ligation wurden die
beiden Fragmente durch eine Disulfidbrücke miteinander verbunden. Mit diesem
schrittweisen Ansatz konnte die Struktur des Nedd4L WW2-WW3 – Smad3 Komplexes
im Detail untersucht werden. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Frage
aufgeworfen wie der Inhibitor-Smad7 durch die WW Domänen der Proteine Nedd4L
und TAZ erkannt wird. Im Zytoplasma bindet Smad7 mit Nedd4L und bewirkt den
Abbau des TGF-ß Rezeptor I während TAZ hauptsächlich im Zellkern vorhanden
ist. ITC Bindungsstudien der individuellen Nedd4L WW Domänen und einem
Smad7-Linker Peptid aus 15 Aminosäuren inklusive dem PY Motiv zeigten, dass
die zweite WW Domänen die bevorzugte Smad7 Bindungsdomäne ist. Die hohe
Bindungsstärke wird von zusätzlichen Kontakten des Smad7 C-Terminus und der
ß1-Strangregion der Nedd4L WW2 Domäne hervorgerufen, sowie durch
elektrostatische Wechselwirkungen des Smad7 N-Terminus und der ersten Schleife
der WW2 Domäne. Dies konnte mittels NMR basierende Strukturanalyse des Nedd4L
WW2 – Smad7[PY] Komplexes verdeutlicht werden. Darüber hinaus zeigten ITC
Experimente, dass die Bindung durch die Präsenz weiterer Nedd4L WW Domänen
nicht verstärkt wird. Der Co-Faktor YAP und sein Paralog TAZ besitzen zwei
(YAP) und eine (TAZ) WW Domäne(n) und wurden ebenfalls als Smad
Bindungspartner beschrieben. Die Bindung zwischen YAP und Smad7 führt zu
verstärktem TGF-ß Rezeptor I Abbau, während die Wechselwirkung zwischen TAZ
und Smad7 bisher noch nicht untersucht wurde. Eine Sequenzanilierung der YAP
und TAZ WW Domänen zeigt eine höhere Sequenzidentität zwischen YAP WW1 und TAZ
WW als zwischen den beiden YAP Domänen. In dieser Arbeit konnte durch ITC
Experimente gezeigt werden, dass die YAP WW1 Domäne das Smad7 Linkerpeptid
stärker bindet als die WW2 Domäne und zwar mit einer ähnlichen Bindungsstärke
wie sie zwischen der TAZ WW Domäne und Smad7 ermittelt wurde. Strukturen der
YAP WW1 Domäne im Komplex mit PY Motiven wurden bereits in der Literatur
mehrfach beschrieben allerdings ist dies das erste Mal, dass die Struktur
einer WW Domäne des humanen TAZ Proteins mittels NMR bestimmt wurde. Im
Vergleich mit Nedd4L binden sowohl TAZ WW als auch Nedd4L WW2 das Smad7 PY
Motiv und den verlängerten C-Terminus sehr ähnlich jedoch sind Unterschiede in
der Wechselwirkung mit dem Smad7 N-Terminus zu erkennen. Zusammenfassend
erweitern die in dieser Arbeit präsentierten Ergebnisse unser Wissen über die
strukturelle und funktionelle Vielseitigkeit der WW Domänen als Protein-
Protein Wechselwirkungsmodule. Darüber hinaus zeigt diese Arbeit, dass
Smad3-Linker Phosphorylierung, welche von verschiedenen Kinasen in einer
bestimmten Reihenfolge durchgeführt wird, die Interaktion mit Nedd4L und Pin1
reguliert. Nedd4L bindet das Smad3 pT[PY] Motiv und zwei weitere
Phosphorylierungsstellen innerhalb des Smad3-Linkers. Die Pin1 WW Domäne
benötigt lediglich eine Phosphorylierungsstelle, welche möglicherweise als
Anker für die Prolyl-Isomerase dient. Pin1 WW Domäne könnte daher an der Smad3
Regulierung beteiligt sein und die Nedd4L – Smad3 Wechselwirkung durch cis-
trans Isomerierung des Smad3-Linkers beeinflussen. Des Weiteren konnte gezeigt
werden, dass Nedd4L durch einen kooperativen, zwei Stufen Modus der
benachbarten Domänen WW2 und WW3 eine hohe Bindungsspezifität gegenüber Smad3
erreicht. Diese Fähigkeit der WW Domänen sowohl pT[PY] als auch pS-pS Motive
zu erkennen war bislang unbekannt. Die Bindung zwischen Nedd4L und Smad7 führt
zur TGF-ß Inhibierung durch den Abbau des TGF-ß Rezeptors I. In dieser Arbeit
konnte gezeigt werden, dass die zweite Nedd4L WW Domäne ausreicht, um das
Smad7[PY] Motiv mit hoher Affinität zu binden. Die WW Domäne des Adapter-
Proteins TAZ interagiert ebenfalls mit dem Inhibitor-Smad7 aber mit einer
etwas schwächeren Affinität. In beiden Komplexen ist die Bindung des PY Motivs
und der C-terminalen Verlängerung sehr ähnlich, sie unterscheiden sich jedoch
in der Erkennung des Smad7 N-Terminus. Diese Differenzen könnten die
unterschiedlichen Funktionen der beiden Wechselwirkungen widerspiegeln. TAZ
war bisher als TGF-ß Agonist bekannt, in dieser Arbeit konnte jedoch gezeigt
werden, dass TAZ auch eine hemmende Funktion im TGF-ß Signalweg einnehmen kann
wie bereits für seine Paralog YAP berichtet wurde.
en
dc.format.extent
XXII, 141 S.
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
TGF-ß signalling
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie
dc.title
Interactions of smads and WW domains of proteins involved in TGF-ß signalling
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. H. Oschkinat
dc.contributor.furtherReferee
Dr. M. Macias
dc.date.accepted
2011-12-15
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000035451-8
dc.title.translated
Wechselwirkungen zwischen Smads und WW Domänen verschiedener TGF-ß Proteine
de
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000035451
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000012435
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open access