Entwicklung und Synthese von Protein-Tyrosin-Phosphatase-Inhibitoren sowie Synthese und Validierung von SHP-2-Inhibitoren in vitro und in vivo

Abstract

Auf Grund fehlerhafter Mechanismen von Protein-Tyrosin-Phosphatasen (PTPs) können humane Krankheiten wie Krebs, Diabetes, kardiovaskuläre und neurobiologische Krankheiten entstehen. Kleine Moleküle können in diesem Zusammenhang als Therapeutika verwendet werden. PTPs sind anspruchsvolle Zielstrukturen, insbesondere die Spezifität von Inhibitoren gegenüber anderen PTPs und ihre häufig fehlende Zellpermeabilität stellen bei der Entwicklung eine Herausforderungen dar. Ausgehend von einem virtuellen Screening mit einem Homologiemodell von SHP-2 wurde die Leitstruktur PHPS1 1 als SHP-2-Inhibitor identifiziert. Es wurde eine Bibliothek von Derivaten synthetisiert, die durch in vitro und in vivo Experimente auf ihre inhibitorische Wirkung hin untersucht wurde. Die SHP-2-Inhibitoren 39, 49 und 50 waren im Enzymassay im nanomolaren Bereich aktiv und selektiv gegenüber SHP-1, PTP1B und MptpA. Sie hemmten zusätzlich die HGF/SF-stimulierte epitheliale-mesenchymale Transition (EMT) von caninen MDCK-C Zellen und von humanen Pankreastumorzellen im niedrigen mikromolaren bzw. nanomolaren Bereich. Die Verbindung 50 zeigte im Softagar-Assay eine signifikante Hemmung der Koloniebildung von zwei verschiedenen humanen Lungentumorzelllinien von bis zu 40 %. Darüber hinaus weisen Tierversuche mit humanen Tumorxenografts daraufhin, dass eine antitumorale Wirkung des Inhibitors 39 in vivo besteht. Insbesondere Verbindung 39 besitzt, durch gute Verträglichkeit im Tierversuch und sehr gute inhibitorische sowie selektive Wirksamkeit, ein hohes Potenzial für die Weiterentwicklung als Krebstherapeutikum. Weiterhin wurde die Entwicklung von PTP-Inhibitoren unter Verwendung von pTyr-Mimetika verfolgt. Der fehlende adäquate Ersatz von pTyr in Leitstrukturen bei der Inhibitorentwicklung stellt immer noch einen limitierenden Faktor dar. Die entwickelten pTyr-Mimetika sollten deswegen ungeladene Strukturen sein, die trotzdem eine starke Wechselwirkung mit der positiv geladenen Aktivtasche der Phosphatasen besitzen. Eine synthetisierte Bibliothek von Fragmenten wurde auf potenzielle pTyr-Mimetika untersucht und anschließend in ein geeignetes Fragment, ein Aldehyd, umgewandelt. Dieses Aldehyd bietet einen einfachen synthetischen Zugang zu neuen potenziellen PTP-Inhibitoren. Dafür wurde eine Aminbibliothek auf ihre Hemmung gegen drei verschiedene PTPs hin untersucht. Zusätzlich wurde die Aminbibliothek durch roboterunterstützte Synthese mit Trifluormethylsulfonamidgruppen versehen und darüber hinaus ein Analogon dieser Gruppe in eine Peptidsequenz eingebaut und validiert. Untersuchungen der synthetisierten Bibliothek von potentiellen pTyr-Mimetika gegenüber MptpA identifizierten Strukturen mit moderater inhibitorischer Hemmung. Die Verbindung 84 wurde folgend in ein Aldehyd umgewandelt und analysiert. Der pKs-Wert der Verbindung 103 von 7,2 und der Wert im Caco-2-Assay von Papp= 24,5 (10-6 cm/s) bestätigen, dass dieses Fragment ein geeigneter Kandidat für die Entwicklung von pTyr-Mimetika ist. Durch das Screenen der Aminbibliothek gegenüber MptpA, SHP-2 und SHP-1 wurden 13 Amine mit einem IC50-Werte von 4 19 µM gefunden. Durch roboterunterstützte Synthese der Trifluormethylsulfonamidverbindungen und deren Validierung, konnten drei Verbindungen, 117_isoliert mit einem IC50-Wert von 86 µM, 118_isoliert und 122_isoliert mit IC50-Werten im Bereich von 500 µM identifiziert werden. Das Trifluormethylsulfonamid-Analogon zeigte in einer Peptidsequenz 136 einen IC50-Wert von 1 mM, der Aminosäurebaustein 134 liegt vergleichsweise bei 40 µM. Zusammenfassend wurde gezeigt, dass sowohl neue, geeignete Verbindungen zur pTyr-Mimetika-Entwicklung als auch Verbindungen für die PTP- Inhibitorentwicklung identifiziert werden konnten.

Aberrant mechanisms of Protein Tyrosine Phosphatases (PTPs) are implicated in a growing number of diseases, ranging from cancer to cardiovascular, immunological, infectious, neurological, and metabolic diseases. Small molecules as PTP inhibitors may provide a solution to this problem as therapeutic agents. PTPs are challenging targets, particularly the specificity of inhibitors against related PTPs and the lack of cell permeability are major challenges. Starting from a virtual screening with a homology model of SHP-2, the lead structure PHPS1 1 was identified as a SHP-2 inhibitor. A library of derivatives was synthesized and evaluated by SAR and in vitro and in vivo experiments for their inhibitory activity. The SHP-2 inhibitors 39, 49 and 50 were most active in the enzyme assay with a nanomolar affinity range and were selective against SHP-1, PTP1B and MptpA. They also inhibit the HGF-stimulated EMT of canine MDCK-C cells as well as human pancreatic tumor cells in the low micromolar and nanomolar range. The compound 50 showed inhibition of the soft agar assay of colony formation of two different human lung tumor cell lines of up to 40 %. Furthermore, in vivo testing with human tumor xenografts showed an anti-tumor effect for the inhibitor 39. This compound in particular, showed well-tolerated behavior in animal studies and very good and selective inhibitory activity. It is therefore considered as a high potential inhibitor for further development as a cancer treatment agent. Furthermore, the development of PTP inhibitors using pTyr mimetics was investigated. The lack of replacement of pTyr in lead structures in the inhibitor development is still a limiting factor. New developed pTyr mimetics should therefore be uncharged structures that still strongly interact with the positively charged active site of phosphatases. A synthesized library of fragments was examined for their potential pTyr mimetic function. The best hit was converted to a suitable aldehyde fragment, which allows easy synthetic access, leading to a potential new inhibitor of PTP. Investigations of the synthesized library of potential pTyr mimetics with MptpA identified structures showed moderate inhibition. Compound 84 was converted into an aldehyde analogue and was evaluated. The pKa of the compound 103 is 7.2 and the value in Caco-2 assay of Papp = 24.5 (10-6 cm/s) confirming this fragment as a suitable candidate for the development of pTyr mimetics. Moreover, a library of amines was examined for their inhibition against three different PTPs. Screening of the amine library against MptpA, SHP-2 and SHP 1 yielded 13 amines with IC50 values of 4-19 µM. In addition, a robot-supported-synthetic trifluoromethylsulfonamide library was evaluated. The library screen yielded compound 117_isolated with an IC50 value of 86 µM, and 118_isolated and 122_isolated with IC50 values in the range of 500 µM. The trifluoromethylsulfonamide group was synthesized as an amino acid analogue. This amino acid building block was incorporated into a peptide that was also evaluated for its inhibitory activity. The analogue of the trifluoromethylsulfonamide in a peptide sequence 136 showed an IC50 value of 1 mM, whereas the amino acid building block 134 yielded 40 µM. In summary, it was shown that new and suitable compounds were identified as pTyr mimetics as well as for the development of PTP inhibitors.