An inducible RNAi system for the functional dissection of genes in the mouse

Abstract

Functional analysis of genes is key to understanding gene regulatory networks controlling embryonic development. I have developed an integrated vector system for inducible gene silencing by shRNA-mir-mediated RNA interference in mouse embryos, as a fast method for dissection of mammalian gene functions. As a validation of the vector system, I have generated loss-of-function phenotypes for Brachyury, Foxa2 and Noto transcription factors - which play pivotal roles in embryonic development - as well hypomorphic phenotypes. Knockdown of genes in this system can be temporally controlled, thus allowing to bypass early embryonic lethality caused by loss-of-function of key developmental genes. Importantly, off-target effects in this system were not detectable at the transcriptome level. As evidence for the merit of this system, I have used two RNAi models for brachyury to study its function during embryogenesis. Analysis of a hypomorphic mutant for brachyury established this gene as regulator of uro-rectal organogenesis during mouse trunk development. This model has now integrated a panel of few others which can be used to understand the molecular mechanisms behind uro-rectal malformations. Additionally, temporal control over the onset of knockdown established brachyury as a key regulator of skeletogenesis, controlling mesenchymal cell induction by the notochord as well as differentiation of the vertebral column. Taken together, the results described here show that this system allows the dissection of gene functions at unprecedented detail and speed.

Für das Verständnis der genregulativen Netzwerke während der Embryonalentwicklung ist die Analyse von Genfunktion essentiell. Eine solche Funktionsanalyse kann durch die gezielte Inaktivierung von Genen erreicht werden. Um eine schnelle und einfache Inaktivierung von Genen zu ermöglichen, habe ich ein flexibles Transgensystem entwickelt, mit dem Gene während der Embryogenese mittels eines miRNA basierten shRNA-Knockdown aus und wieder angeschaltet werden können. Zur Validierung dieses Systems wurden Embryonen generiert, in denen die Transkriptionsfaktoren Brachyury, Foxa2 und Noto partiell (hypomorph) und vollständig inaktiviert wurden. Embryonen mit kompletten Knockdown phänokopieren beschriebene Knock-Out Phänotypen. Im Gegensatz zum konventionellen Knockout Experiment, ist der Knockdown in meinem Transgensystem zeitlich kontrollierbar, was die Analyse von Genen, die in der frühen Embryogenese eine essentielle Funktion haben und deren Funktionsverlust zu früher embryonaler Letalität führt, zu späteren Zeitpunkten der Entwicklung ermöglicht. Unspezifische Effekte der Expression der miRNAs, waren in diesem System nicht detektierbar. Im zweiten Teil der Dissertation habe ich zur weiteren Validierung des Systems und zu einer genaueren Analyse der Funktion von Brachyury , zwei verschiedene Modelle für die Inaktivierung von Brachyury verwendet. Zum einen zeigte die Analyse der hypomorphen Variante von Brachyury, dass Brachyury eine wichtige Funktion bei der Etablierung des Urogenitaltraktes während der Rumpfentwicklung übernimmt. Hiermit wurde eines der ersten Mausmodelle für die Untersuchung von urorektalen Fehlbildungen, die auch in der menschlichen Entwicklung auftreten, etabliert. Zum Anderen konnte ich durch die komplette Inaktivierung von Brachyury zu einem späteren Zeitpunkt der Embryogenese zeigen, dass Brachyury eine entscheidende Rolle bei der Skelettentwicklung hat. Brachyury kontrolliert hierbei die Induktion von mesenchymalen Zellen über den Notochord, als auch die Differentierung der Wirbelsäule. Zusammenfassend, konnte ich innerhalb der Dissertation darlegen, dass das von mir entwickelte Transgensystem eine schnelle, effektive und flexible Analyse von Genfunktion erlaubt.