Fremdkörperreaktion nach Stimulation der Frakturheilung durch die Wachstumsfaktoren IGF-1 und TGF-ß1

Abstract

Trotz ständig verbesserter Therapieoptionen in der Unfallchirurgie und Orthopädie stellt die Behandlung komplexer Frakturen der Röhrenknochen weiterhin ein großes Problem dar. Eine Vielzahl von Komplikationen korreliert hierbei direkt mit der Behandlungsdauer. Durch die exogene Applikation von Wachstumsfaktoren kann die Frakturheilung beschleunigt und die Gefahr dieser Komplikationen verringert werden. Vorraussetzung für die problemlose Anwendung ist eine gute Biokompatibilität der applizierten Faktoren und des Trägermaterials. Ziel der vorliegenden Arbeit war es die Biokompatibilität einer biodegradierbaren und bereits etablierten Poly(D,L-Laktid)-Beschichtung als Wirkstoffträger für die Wachstumsfaktoren IGF-1 und TGF-ß1 in Bezug auf mögliche inflammatorische Reaktionen im Rahmen der Frakturheilung zu untersuchen. Nach Setzen einer standardisierten Fraktur am rechten Tibiaschaft von 6 Monaten alten, weiblichen Sprague Dawley Ratten erfolgte die osteosynthetische Versorgung mittels intramedullären Titan Kirschner Drähten der Stärke 1,0 mm. Neben der unbeschichteten Kontrollgruppe, wurde eine Gruppe mit einem Poly(D,L-Laktid) beschichteten Implantat (PDLLA) und eine dritte Gruppe mit PDLLA + IGF-I/TGF-ß1 versorgt. Bei der Beschichtung handelte es sich um eine 10 µm dünne Beschichtung, die in einem kalten Tauchverfahren aufgetragen wurde. Nach 5, 10, 15 und 28 Tagen wurden die Tiere getötet und die rechte Tibia entnommen. Zur histologischen Beurteilung des Kallusgewebes wurde zunächst eine Färbung mit Safranin O/Lichtgrün durchgeführt. Zur Klärung der Biokompatibilität und Untersuchung der Fremdkörperreaktion wurde in der vorliegenden Studie eine immunhistologische Färbung mit ED1-Antikörper durchgeführt. Das von Monozyten und Makrophagen exprimierte Glykoprotein ED1 ist homolog gegenüber dem humanen CD68 und wird von antigenpräsentierenden Zellen im Rahmen einer Entzündungsantwort an der Oberfläche präsentiert. Des weiteren wurden mittels der Tartrat resistenten sauren Phosphatase (TRAP) Färbung Osteoklasten dargestellt, die im Rahmen von Osteolysen bei einer Fremdkörperreaktion eine Schlüsselrolle einnehmen. Die Auswertung der Färbungen erfolgte mittels semiquantitativer Bildanalyse. Dabei wurde zunächst eine region of interest (ROI) definiert. Ausgehend vom Kortikalisdurchmesser in Höhe des Frakturspaltes (sog. Baseline) wurde diese Strecke mit jeweils 1,5 multipliziert und nach proximal und distal vermessen. Innerhalb dieser ROI wurde nun die gefärbte Fläche (ED1 bzw. TRAP-Aktivität) prozentual ins Verhältnis der gesamten Fläche gesetzt. Bereits 5 Tage nach Fraktur zeigte sich in der PDLLA- und Wachstumsfaktorengruppe ein deutlich ausgeprägterer Kallus als in der Kontrollgruppe. Bis zum 15. Tag kam es in allen drei Gruppen zu einer deutlichen Zunahme des Kallusvolumens mit zunehmender Abgrenzung des weichen vom harten Kallus. Im Vergleich zur Kontrollgruppe, zeigte sich in den beiden anderen Gruppen ein deutlich höherer Anteil trabekulären Geflechtknochens als Zeichen einer fortgeschrittenen Frakturheilung. Insbesondere 28 Tage nach Fraktur konnte in der Wachstumsfaktorengruppe ein deutlich fortgeschrittenes Kallusremodelling beobachtet werden. In der Immunhistologie zeigten sich 5, 10 und 15 Tage nach Fraktur zwischen den Gruppen keine Unterschiede bezüglich der Anzahl und der Lokalisation der Zellen. In allen Gruppen zeigten sich ED1 positive Zellen in Nähe des Frakturspaltes. Weder die verwendete Poly(D,L-Laktid) Beschichtung noch die inkorporierten Wachstumsfaktoren induzierten ein vermehrtes Auftreten von ED1 positiven Makrophagen oder Monozyten im Vergleich zur unbeschichteten Kontrollgruppe. Interessanterweise zeigte sich 28 Tage nach Fraktur in der Wachstumsfaktorengruppe eine signifikant reduzierte Immunreaktivität für ED1 im periostalen Kallus im Vergleich zur Kontrolle. Eine Ursache hierfür könnte die in Langzeituntersuchungen nachgewiesene beschleunigte Frakturheilung durch die Wachstumsfaktoren sein, wodurch auch ein schnelleres Abklingen der Inflammation erklärt werden könnte. Innerhalb der Gruppen war 10 und 15 Tage nach Fraktur eine vermehrte Anzahl von Monozyten/Makrophagen und Osteoklasten nachweisbar als 5 und 28 Tage nach Fraktur. Bei der Untersuchung TRAP positiver Zellen konnten über den gesamten Zeitverlauf von 28 Tagen nach Fraktur keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen festgestellt werden. Während 5 und 28 Tage nach Fraktur periostal in keiner der Gruppen TRAP positive Zellen nachgewiesen werden konnten, kam es im Verlauf gruppenunabhängig 10 und 15 Tage nach Fraktur in der Kontrollgruppe tendenziell zu einem vermehrten Anstieg TRAP positiver Osteoklasten im periostalen Kallus. Weitere Untersuchungen an histologischen Präparaten zeigten auch nach 84 Tagen keine Anzeichen für vermehrte Osteolysen. Zusammenfassend kann somit beobachtet werden, dass die hier verwendete bioaktive Beschichtung eine gute Biokompatibilität für die untersuchten Zeitpunkte aufweist und eine signifikante Stimulation der Heilung durch die lokal applizierten Wachstumsfaktoren erfolgte

Healing of complex fractures in orthopaedic surgery is still a problem because of possible complications due to the duration of healing. Exogenous application of growth factors can stimulate the healing process by use of a coated implant as drug carrier. Due to reports of possible foreign body reactions it is important to carefully investigate the biocompatibility of the used polymer before clinical use. The aim of this study was to investigate the biocomatibility of a 10 µm thin well established biodegradable poly(D,L-lactide) coating with the growth factors IGF-I and TGF-1 on fracture healing of standardized tibial fracture of 5-month-old female Sprague Dawley rats. Therefore, the amount of monocytes/macrophages was detected by using an monoclonal antibody against ED1 (comparable to CD68 in humans). Furthermore the spreading of osteoclasts was detected by using tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP). For histological investigations a Safranin O staining was performed. Tibial fractures of group 1 were treated with uncoated titanium K-wires, of group 2 with PDLLA-coated wires and of group 3 with IGF-I and TGF-1 coated wires. At day 5, 10, 15 and 28 the fracture calluses were analysed. For the evaluation of the staining the endosteal and the periosteal callus area were observed separately in a defined region of interest (ROI) with an image analysis system. The amount of stained area was measured and correlated to the unstained area in percent. Histologically a clearly higher amount of callus formation was seen in the PDLLA- and growth factors group already 5 days after fracture. One could differentiate a hard from a soft callus, which was much more expressed in the growth factors group 15 days after fracture as a sign for stimulated fracture healing in this group. The ED1 staining showed no differences between the three groups 5, 10 and 15 days after fracture. All positive stained cells were detected near the fracture gap. Neither the PDLLA coating nor the growth factors revealed a higher amount of monocytes/macrophages as a sign for a pronounced foreign body reaction. Interestingly 28 days after fracture a significantly higher immunoreactivity of ED1 was detectable in the control group in the callus area in comparison to the growth factors group. Due to the investigated faster healing through the applied growth factors, the inflammatory process during fracture healing could be already completed in this group while the inflammation is still in process in the uncoated control group. At day 10 and 15 higher amount of stained areas were detected in all groups then at day 5 and 28 days after fracture. The TRAP staining showed no significant differences between the three groups. Whereas no TRAP-positive cells were detectable 5 and 28 days after fracture there were cells stained 10 and 15 days after supply, even if there was a trend for more detectable osteoclasts in the control group. In conclusion, there was no indication for a foreign body reaction due to the use of the PDLLA coating or the growth factors indicating a good short-term biocompatibility.