dc.contributor.author
Stauber, Barbara
dc.date.accessioned
2018-06-07T22:19:57Z
dc.date.available
2008-10-13T09:01:55.603Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/9136
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-13335
dc.description.abstract
Die Entdeckung von HIV-1 und HIV-2 als den Erregern von AIDS liegt nun mehr
als 20 Jahre zurück und noch immer ist diese neuzeitliche Infektionskrankheit
nicht heilbar oder mit einem Wirkstoff prophylaktisch zu bekämpfen. Das HI-
Virus ist ein in hohem Maße optimiertes System, das mit nur wenigen Genen
absolut effizient funktioniert. Dabei erfüllt jedes virale Protein in vivo
eine für das Virus bedeutsame Funktion und bietet einen potentiellen Ansatz
für antiretrovirale Therapien. Da akzessorische und regulatorische Proteine im
Replikationszyklus des HIV früh entstehen – damit also in die Virusvermehrung
zeitig eingegriffen werden könnte – stellen sie darüber hinaus ein attraktives
Ziel für zellvermittelte antivirale Impfstrategien dar. Nach dem bisher
vergeblichen Versuch, einen Impfstoff zu entwickeln, der mittels Induktion
einer humoralen Abwehr vor der Infektion mit dem Retrovirus schützt,
konzentriert sich die Forschung zunehmend auf die Induktion einer zellulären
Abwehr. Diese wird durch zytotoxische T Lymphozyten (CTL) vermittelt, die
infizierte Zellen anhand der auf der Zelloberfläche in den Bindungstaschen der
MHC-Moleküle präsentierten viralen Proteine spezifisch erkennen und abtöten.
Zur Entwicklung eines auf zellulärer Abwehr basierenden Impfstoffes ist also
sowohl der HLA-Typ des Wirtes von Bedeutung, der die Form und
Bindungseigenschaften der MHC-Moleküle bestimmt, als auch die entsprechend
präsentierten viralen Peptide. Als Reaktion auf den antiviralen Druck durch
die CTL verändert sich das Virusgenom im Bereich der Epitope, um von dem
Immunsystem nicht mehr erkannt zu werden. Diese als „Fluchtmutationen“
bezeichneten Veränderungen des HIV-Genoms erhöhen dessen Variabilität und
erschweren die Generierung eines nachhaltig wirksamen und effizienten
Impfstoffes. Die vorliegende Arbeit ist thematisch einzuordnen in die
Entwicklung eines prophylaktischen oder therapeutischen Wirkstoffes, der auf
der Induktion einer zellulären Immunantwort basiert. Ziel war die genaue
Analyse von CTL-Epitopen in den akzessorischen Proteinen Vif, Vpr, Vpu und den
regulatorischen Proteinen Rev, Tat vor dem Hintergrund des individuellen HLA-
Typs des Wirtes. Die Hypothese war, dass aufgrund des antiviralen Drucks durch
spezifische CTL, die Aminosäurevariabilität innerhalb der CTL-Epitope erhöht
ist. Dazu erfolgte die HLA-Typisierung von HIV-infizierten Patienten mit
anschließender Auswahl von 11 HLA A2-positiven und sechs HLA A2-negativen
Patienten (zehn Langzeitinfizierte, sieben akut Serokonvertierte). Es wurden
von 19 Patientenproben (17 Patienten) 180 HIV-Klone sequenziert und die
resultierenden 900 Proteinsequenzen qualitativ und statistisch analysiert. In
der qualitativen Analyse der CTL-Epitope und der örtlichen Variationen der
Proteinsequenzen konnte keine eindeutige Korrelation zwischen Variabilität und
Epitoplokalisation festgestellt werden. Die HLA A2-spezifische Auswertung
zeigte nur singulär auffallende Ergebnisse: so weist z.B. ein CTL-Epitop in
Vpr eine eindeutig erhöhte Variabilität in den A2-positiven Proben von
Langzeitinfizierten (LTNP) im Vergleich zu den A2-negativen auf, was auf
Fluchtmutationen hinweist. Ein umfassendes Muster der Variationen im Sinne von
gezielten Fluchtmutationen lässt sich jedoch nicht erkennen. Bei
Gegenüberstellung der HIV-Sequenzen von Proben nach unterschiedlicher
Infektionsdauer war zu erkennen, dass die Zahl der Quasispezies in einigen
Proteinsequenzen bei der Gruppe der akut Serokonvertierten erhöht war. Dies
deutet darauf hin, dass sich die dominante Virusform nach kurzem
Infektionsverlauf noch nicht durchsetzen konnte. Auffällig war außerdem das
oben bereits erwähnte CTL-Epitop in Vpr, das unter den akut Serokonvertierten
ob A2-positiv oder A2-negativ – keine Differenzen zeigte. Hier haben
spezifische CTL möglicherweise noch keinen effizienten Selektionsdruck
ausgeübt oder die Zeit zur Ausbildung von Escape-Varianten war nicht
ausreichend. Bei Analyse von mehreren Blutproben eines Patienten im
Infektionsverlauf gelang die Dokumentation der Selektion der dominanten
Quasispezies, sowie die des Auftretens einer möglichen Fluchtmutation
innerhalb eines CTL-Epitops. Ebenso zeigte sich eine stets gekoppelt
auftretende Aminosäurevariation als möglicher Hinweis auf eine
kompensatorische Mutation. In der statistischen Auswertung konnte die
Hypothese, die von einer erhöhten Aminosäurevariabilität innerhalb der CTL-
Epitope ausging, nicht bestätigt werden. Statistisch signifikante Ergebnisse
konnten nicht durchgehend erhoben werden. Die Zahlen deuten darauf hin, dass
die Variabilität innerhalb der Epitope im Vergleich der außerhalb der Epitope
in den hier untersuchten Genen und Genabschnitten nicht erhöht ist. Für
eindeutigere Aussagen sind Untersuchungen mit einer größeren Anzahl an
analysierten HIV-Sequenzen notwendig. Die erhobenen Daten bieten jedoch
bereits eine gute Grundlage für weitere Studien, insbesondere für solche, die
die zelluläre Ebene in die Analyse einbeziehen.
de
dc.description.abstract
The discovery of HIV-1 and HIV-2 as the causative agent of AIDS occurred 20
years ago, and despite intensive efforts worldwide all attempts to develop an
effective AIDS vaccine or cure have so far failed. HIV is a highly optimised
system operating with only a few genes in a highly efficient manner. Each
viral protein plays a significant role in vivo and therefore offers a
potential target for anti-retroviral therapy. Accessory and regulatory
proteins are produced early in the replication cycle of HIV and are therefore
good targets for the early inhibition of virus reproduction and an attractive
basis for antiviral vaccines. After the early failure of vaccines designed to
stimulate a humoural immune response, research has increasingly concentrated
on the induction of HIV-specific cellular immunity mediated by cytotoxic
T-lymphocytes that recognise infected cells via viral protein fragments
presented by MHC-molecules. The efficacy of such a vaccine in humans would
depend on the HLA-type of the host as this determines the pattern of epitope
recognition and binding/presentation capacity. In response to the antiviral
pressure exerted by CTLs, HIV can mutate in regions coding for the presented
epitopes in order to avoid recognition by the immune system. Such genomic-
variants are termed “escape-mutations” and severely complicate the development
of a long-term, efficient vaccine. The project described in this thesis is
thematically aimed at the development of a prophylactic or immunotherapeutic
agent against HIV by induction of cellular immunity. The aim was to accurately
analyse CTL-epitopes within the accessory proteins Vif, Vpr, Vpu and the
regulatory proteins Rev and Tat against the background of the host's
individual HLA-haplotypes. The working hypothesis was that as a result of the
antiviral pressure exerted by specific CTLs the variability of the amino acids
sequence within such epitopes is increased compared to those regions not
recognised by CTLs. To accomplish this, HIV-positive patients were HLA-typed
and 11 HLA A2-positive and six HLA A2-negative patients (ten long-term
infected, therapy-naïve patients and seven acute seroconverters) were
selected. Altogether 180 HIV clones from 19 samples (17 patients) were
sequenced and the corresponding 900 protein sequences qualitatively and
statistically analysed. The analysis of CTL-epitopes and their variation in
the different proteins revealed no clear correlation between variability and
localisation within epitopes. The HLA-A2-specific analysis showed only
individual cases of correlation. For example, the variability in one of the
CTL-epitopes in Vpr was significantly higher in viruses from A2-positive long-
term infected patients compared to those from A2-negative patients –
suggesting possible escape-mutations. However, a clear and generalised pattern
of protein variation with regard to specific escape-mutations could not be
identified. HIV sequences from samples taken after a short period of infection
(acute seroconverter cohort) showed a relatively elevated number of
quasispecies. This suggests that the dominant quasispecies still hadn't been
selected for during the short time of infection. It was also noticeable that
the CTL epitope in Vpr mentioned above showed in neither A2-positive nor
A2-negative patients any increase in variability. It is likely that either the
specific CTLs had not expanded enough to exert an effective selective pressure
or that the virus had not yet had time to develop a dominant population of
escape mutants. By analysing several samples from one patient during the
course of infection, it was possible to document the selection of the dominant
quasispecies, as well as the appearance of a probable escape mutation within a
CTL epitope. Similarly, the appearance of a variation always in tandem with a
second variant suggested the forced development of a compensatory mutation. It
was not possible by statistical analysis of all the data to verify the
hypothesis that the amino acid variability within the CTL-epitopes of the
proteins studied is significantly elevated. The statistically significant
differences were limited to individual cases. Overall, there was no evidence
that variability within epitopes is generally higher than in regions not
recognised by CTLs. To confirm this finding it will be necessary to analyse a
larger number of HIV sequences. However, the results presented here provide a
solid basis for future studies, particularly for those including an actual
examination of the cell-mediated immune responses in the patients.
en
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject.ddc
600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften::610 Medizin und Gesundheit
dc.title
HIV-1-Variabilität als Antwort auf den Selektionsdruck durch zytotoxische
Lymphozyten
dc.contributor.contact
barbara.stauber@charite.de
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. med. Dr. h.c. R. Kurth
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. G. Sutter
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. R. Ignatius
dc.date.accepted
2008-11-21
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000005592-5
dc.title.subtitle
eine Genanalyse
dc.title.translated
HIV-1 variability in answer to selection pressure by cytotoxic T lymphocytes
en
dc.title.translatedsubtitle
a genetic analysis
en
refubium.affiliation
Charité - Universitätsmedizin Berlin
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000005592
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000004496
dcterms.accessRights.dnb
free
dcterms.accessRights.openaire
open access