Analysis of mutant huntingtin aggregation and toxicity in Drosophila models of Huntington’s disease

Abstract

Chorea Huntington (HD) wird durch eine CAG-Repeat-Verlängerung im Exon-1 des Huntigtin-Gens verursacht. Die Krankheit ist durch fortschreitende motorische, kognitive und psychiatrische Beeinträchtigungen charakterisiert. Umden molekularen Pathomechanismus vonHDin vivo zu analysieren, wurden neue Drosophila melanogaster Modelle etabliert, die verschiedene N-terminale HTT Fragmente sowieVolllängen-HTT exprimieren. Die HTT Fragments enthalten Polyglutamin (PolyQ)-Sequenzen mit verschiedenen Längen. Für die Herstellung der transgenen Fliegen wurde das PhiC31 Integrationssystem verwendet, dass eine ortsspezifische Integration des Transgenes in das Genom der Fliege vermittelt. Eine systematische biochemische und verhaltensspezifische Charakterisierung der transgenen Fliegen, die das HTT Exon-1 Fragment sowie Volllängen-HTT konstitutiv mittels des GAL4 / UAS Expressionssystems exprimieren, zeigte einen Polyglutaminlängen abhängigen Phänotyp. Im Anschluss wurde eine induzierbares Fliegen-Modell etabliert und systematisch charakterisiert. Das induzierbare System erlaubt die Expression von normalen und mutierten HTT Exon-1 Fragmenten in Fliegen, die bereits das Erwachsenenalter erreicht haben. Darüber hinaus ermöglicht das Expressionssystem die Unterdrückung der Expression zu einem gewünschten Zeitpunkt. Die chronische Expression eines mutierten HTT Exon-1 Proteins mit 97 Glutaminen im Erwachsenenalter führte zu einer Akkumulation von HTT Aggregaten im Fliegengehirn, sowie zu einer verkürzten Lebensspanne und einer spätmanifesten Beeinträchtigung der Bewegungsfähigkeiten. Die Verkürzung der Expressionszeit führte nur zu ähnlichen Bewegungsbeeinträchtigungen sowie verkürzten Lebensspanne. Dabei zeigte sich, dass das Alter der Fliegen keinen Einflußauf den Phänotyp hat. Zudem blieb die Aggregatmenge nach abschalten der Expression gleich. In weiteren Analysen wurde gezeigt, dass die Co-Expression von HSPA1L die Menge an HTT Aggregaten reduziert und die durch das mutierte HTT vermittelte Toxizität signifikant verringert wird. Schließlich konnte der Effekt von kleinen Molekülen auf die Aggregation des HTTex1Q97 Proteins demonstriert werden. Im Zuge dieser Arbeit wurde ein induzierbares Fliegen- Modell für HD etabliert und in Bezug auf Langzeit- und Kurzzeit-Expression systematisch charakterisiert. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass die Reduzierung des krankheitsverursachenden Proteins, als alleiniger Therapieansatz, vermutlich keine vielversprechende Verbesserung bringen kann. Darüber hinaus bietet der quantifizierbare Phänotyp des induzierbaren Fliegen- Modells die Möglichkeit, die Wirkung von Proteinen sowie kleinen Molekülen auf die Aggregation und die Toxizität von mutierten HTT zu untersuchen.

Huntington’s disease (HD) is caused by an elongated CAG repeat located in the exon-1 huntigtin (HTT) gene. The disease is characterized by progressive motor, cognitive, and psychiatric impairments. In order to analyze the molecular pathomechanism of HD in vivo, new Drosophila melanogaster models of HD that express different N-terminal huntingtin (HTT) fragments as well as full-length HTT were established. The different HTT fragments contain polyglutamine (polyQ) sequences of different lengths, including wild-type and mutant-associated lengths. The transgenic flies were generated using PhiC31-mediated insertion of different HTT transgenes at the same genomic landing site. A systematic biochemical and behavioral characterization of transgenic flies that express the HTT exon-1 fragments or full-length proteins using the constitutive GAL4 / UAS expression system revealed locomotor impairments and shortened survival in a polyQ-length dependent manner. Next, an inducible pan-neuronal Drosophila model of HD was established and systematically characterized. The inducible expression allows the production of the wild-type and mutant HTT exon-1 proteins exclusively in the adulthood of flies. Furthermore, the inducible Gene-Switch expression system enables researchers to turn off the production of the HTT proteins after a selected period of time. The chronically adult-onset production of a mutant HTT exon-1 protein with 97 glutamines (HTTex1Q97) led to a rapid accumulation of mutant HTT aggregates in fly brains and caused shortening of the life span and late- onset motor impairments. Interestingly, short-time expression of the HTTex1Q97 fragment in adult flies revealed very similar locomotor impairments and reduced survival. However, age does not influence the effect of the mutant HTT protein on the survival of flies. Finally, after the short-time expression of the HTTex1Q97 protein in fly brains the amount of insoluble HTT aggregates increased over time until a steady state level was reached. Further analysis showed that co-expression of HSPA1L reduces the amount of HTT aggregates and suppresses the mutant HTT-induced toxicity in transgenic flies. Finally, the effects of chemical compounds on mutant HTT protein aggregation were investigated. Taken together, in this study an inducible fly model of HD was established and systematically characterized for long-time and short-time protein expression. The findings of this thesis show that the decrease of mutant HTT expression when HTT aggregates have already formed has a minor effect on the disease progression. Moreover, the quantifiable survival phenotype of the inducible HD fly model presented in this study facilitates the investigation of chemical compounds that might influence the pathogenesis of HD.