Die Rolle der Neurotrophine und die Aktivierung Dendritischer Zellen bei der Pathogenese allergischer Erkrankungen

Abstract

Hintergrund: Bei Dendritischen Zellen handelt es sich um Antigenpräsentierende Zellen, die an der Schlüsselstelle zwischen Körper und Außenwelt stehen. Durch Aufnahme und Prozessierung von in den Körper eingedrungener Fremdantigene können sie eine adaptive Immunantwort in Gang setzen. In den letzten Jahren sind sie auf dem Gebiet der Allergologie immer mehr in den Fokus des Interesses gerückt. Die bei Allergien überwiegende TH2-Antwort auf Allergene ist zum großen Teil auf eine Sensibilisierung durch Dendritische Zellen zurückzuführen. Die Neurotrophine, Proteine, bei denen man zunächst annahm, dass sie ihre hauptsächliche Rolle im Nervensystem spielen, sind bei Allergikern und Asthmatikern sowohl im Blut als auch in durch BAL (bronchioalveoläre Lavage) gewonner Flüssigkeit erhöht nachgewiesen worden. Dies warf die Frage auf, inwieweit zwischen Dendritischen Zellen und Neurotrophinen ein Zusammenhang besteht. Methoden: Die Dendritischen Zellen wurden aus Monozyten generiert, welche aus dem Blut allergischer sowie gesunder Probanden isoliert worden waren. Durch 7tägige Zellkultur in Medium mit IL-4 und GM-CSF bildeteten sich MoDCs (monocyte derived dendritic cells). Um Neurotrophine und ihre hochaffinen spezifischen Rezeporen der MoDCs nachzuweisen, wurden FACS, ELISA und Western Blot verwendet. Die Untersuchung von Neurotrophinen und ihrer Rezeptoren kodierender mRNA wurde mit rt-PCR durchgeführt. Um die Rezeptoraktivierung und Signaltransduktionswege Dendritischer Zellen zu evaluieren, wurden eine Immunpräziptation und ein Rho/Rac pull down assay verwendet. Für die ELISA- und Western Blot- Untersuchungen wurden zwei verschiedene Probanden-gruppen gebildet, Allergiker und Nichtallergiker. Ergebnisse: Die Untersuchungen wiesen die Neurotrophine NGF, BDNF und NT-3 sowie die hochaffinen spezifischen Rezeptoren mittels FACS und Immunfluoreszenz auf intakten Zellen nach. Auf Proteinebene konnten NGF und BDNF sowie TrkA und TrkB nachgewiesen werden. NGF und BDNF wurden vor allem bei Allergikern selektiv durch LPS hochreguliert. Die Banden im Bereich von TrkA und TrkB zeigten bei Allergikern ebenfalls eine stärkere Intensität nach Stimulation mit LPS. Die rt-PCR zeigte für die Neurotrophine NGF und BDNF positive Ergebnisse. TrkB wurde durch Stimulation mit LPS und CD40L selektiv hochreguliert. Bei der quantitativen Analyse mittels ELISA zeigte sich, dass vor allem BDNF nach LPS- und Allergenstimulation signifikant erhöht war, während die Produktion von NGF kaum beeinflussbar war. Die Unterscheidung zwischen Allergiker und Nichtallergiker spielte hier keine Rolle. Nach Stimulation mit den Neurotrophinen NGF und BDNF konnte mittels Immunpräzipitation eine Rezeptorphosphorylierung von TrkA und TrkB nachgewiesen werden. Im Rho/Rac pull down assay, dass die GTPasen RhoA und Rac von NGF und BDNF unterschiedlich reguliert werden. Während RhoA durch BDNF hochreguliert und von NGF herunterreguliert wurde, wurde Rac durch NGF hochreguliert und durch BDNF herunterreguliert. Die Messung verschiedener Zytokine in den Überständen mittels ELISA zeigte bei Allergikern ein erhöhtes IL-6, während bei Nichtallergikern IL-10 erhöht vorlag. Schlussfolgerung: Diese Ergebnisse weisen auf eine mögliche Rolle der durch Dendritische Zellen produzierten Neurotrophine beim allergischen Asthma bronchiale hin. Bei den Untersuchungen zeigte sich, dass die Dendritischen Zellen sowohl auf Stimulation mit Neurotrophinen reagieren als auch als Produktionsquelle für Neurotrophine fungieren. Vor allem TrkB und BDNF sind durch Stimulation mit LPS hochregulierbar, was darauf hindeuten könnte, dass BDNF einen Botenstoff darstelllt, der an der Sensibilisierung von TH2-Zellen mitwirkt. Aus dem Ergebnis der Immunpräzipitation lässt sich ableiten, dass NGF und BDNF durch TrkA und TrkB ihre Wirkungen auf Dendritische Zellen ausüben. Die Antwort der DCs auf Stimulation mit NGF und BDNF, die bei Allergikern in einem erhöhten IL-6 und bei Nichtallergikern in einem erhöhten IL-10 besteht, deutet darauf hin, dass die Neurotrophine eine Rolle bei dem bei Allergien vorherrschenden zellulären Ungleichgewicht spielen könnten. Da es sich bei diesen Zellen um monocyte derived DCs handelt, ist es unwahrscheinlich, dass sie schon mit Allergenen sensibilisiert sind. Hieraus lässt sich schließen, dass vererbbare Ursachen bei der Entstehung allergischer Erkrankungen mitwirken. Die Ergebnisse des Rho/Rac pull down assays deuten darauf hin, dass NGF und BDNF unterschiedliche Funktionen hinsichtlich essentieller Funktionen der Dendritischen Zellen wie die Ausbildung von Dendriten und Migration ausüben.

Background: Dendritic Cells (DC) are antigen presenting cells which play a key role in the defense of antigens that invade the body. By uptake and processing of foreign antigens they can trigger the adaptive immune response. In the pathogenesis of allergy they may play a pivotal role by sensitizing t helper cells to become th2 cells, which are essential for the development of allergic diseases. The neurotrophins among which the best known members are NGF, BDNF and NT-3 are proteins that play an important role in the depelopment and plasticity of the nervous system. In recent years one became aware that they also may be important in the development of allergic diseases as they were found in increased amounts in blood and BALF (bronchoalveolar lavage fluid) in allergics and asthmatics. The intention of these investigations was to find out wether DCs and neurotrophins interact with each other. A group of allergics was compared to a group of non allergics. Methods: The DCs were generated from monocytes isolated from peripheral blood from allergics and non allergics. By 7 day cell culture with medium, IL-4 and GM-CSF the moncytes turned into DCs and were therefore called MoDCs (monocyte derived DCs). In order to evaluate if Dendritic Cells express neurotrophins ELISA, Western Blot and PCR were used. A group of allergics was compared to a group of nonallergics. Furthermore immunofluorescence was used in order to detect neurotrophins on hole DCs and immunoprecipitation to find out whether the neurotrophin high affinity receptors were activated on DCs. A Rho/Rac pull down assay was used in order to investigate the signal transduction way through which neurotrophins act in Dendritic Cells. Results: By immunofluorescence and FACS NGF, BDNF and NT-3 could be detected on whole cells. On the protein level NGF, BDNF, TrkA and TrkB could be found. NGF and BDNF were seletivly upregulated by stimulation with LPS, especially in allergics. Also TrkA and TrkB showed a stronger intensity in allergics after stimulation with LPS. In the PCR could be shown that DCs are a source of NGF and BDNF, whereas among the receptors only TrkB could be seen after stimulation with LPS. With ELISA there could be shown that BDNF was significantly upregulated by stimulation with LPS and allergen whereas NGF showed no such effect. There were no significant differences between allergics and non allergics. Among the interleukins IL-6 was upregulated in allergics and IL-10 was upregulated in non allergics after stimulation with LPS and allergen. After stimulation with neurotrophins a receptor phosphorylation could be detected by immunoprecipitation. With the Rho/Rac pull down assay, different regulation of the GTPases Rho and Rac by NGF and BDNF could be seen. RhoA was upregulated by BDNF and downregulated by NGF. Rac was upregulated by NGF and downregulated by BDNF. Conclusions: These results show a possible role of the neurotrophins produced by DCs. Both a reaction of DCs on stimulation with neurotrophins and production of neurotrophins by DCs could be shown. Particularly BDNF and TrkB were upregulated by stimulation with LPS and allergen. This could indicate a possible role of this neurotrophin in sensitizing th2 cells. The results of the immunoprecipitation show that NGF and BDNF act on DCs through TrkA and TrkB. The altered production of the cytokines IL-6 and IL-10 could be a sign of neurotrophins being one of the triggers of the cellular imbalance in the pathogenesis of allergic diseases. As the DCs were monocyte derived DCs, they could no have been sensitized with allergen. This suggests genetic causes in the development of allergy. The different regulation of the cell cycle proteins RhoA and Rac indicate different roles of NGF and BDNF in the formation of essential processes like the formation of dendrites and migration.