DNA Shape and Sequence of Binding Sites Modulate Regulation of Gene Expression by the Glucocorticoid Receptor

Abstract

In my thesis, I studied the details of gene regulation by the glucocorticoid receptor (GR), a nuclear hormone receptor acting as a transcription factor. My aim was to better understand how sequence variants bound by the same transcription factor may play a role in the fine-tuning of gene expression. GR is an important therapeutic target in medicine and has been intensively studied. Despite our broad understanding of GR action, we still do not fully understand the details of gene regulation. Researchers found that different GR binding sequence (GBS) variants induce different levels of GR activity, which is seemingly disconnected from \textit{in vitro} binding affinity of GR \cite{ Meijsing2009a}. It was hypothesized that DNA allostery might explain the differences in GR activity. Additionally, classical enhancer studies, which have been mostly used so far, only allow low-thoughput studies of the effect of sequence variants on GR activity. I developed and implemented a modified version of the STARR-seq (self-transcrib-ing active regulatory region sequencing) method for quantitative massively parallel assessment of short synthesized GBS variants for their ability to fine-tune GR action. I found that GBS variants and sequences flanking a GBS indeed modulate GR activity. For example, I identified a new GBS variant, which is C-rich and leads to strong GR dependent up-regulation of a target gene. I also studied GR dependent activation of endogenous genes and found that the direct flanking bases have an important role. At these positions, A/T are associated with strong up-regulation, but G/C are associated with weak regulation. To understand the effect induced by GBS flanking sites on GR action, I conducted structural experiments of the DNA and the DNA:GR protein complex. I found that the difference in activation of target genes was uncorrelated with binding affinity \textit{in vitro} and \textit{in vivo}. Further, DNA structure prediction showed that the flanking bases induce structural changes adjacent to and within the GBS. For GR, the different structural experiments revealed that the conformation of the dimer partners, the dynamics and the relative position of the dimer partners are affected by flanking bases. Altogether, these findings suggest that DNA allostery might induce different structural conformations in GR that affect GR downstream of binding and modulate its action. In the last part of my thesis, I found that the composition of the GR response element influences the level of expression noise. For example, multiple GR binding sites yield high expression and noise, whereas composite binding sites harboring a GR binding site and a binding site for other transcription factors results in high expression with relatively little noise. In summary, I could show that GBS variants affect fine-tuning of gene expression by GR and that DNA allostery might play an important role in fine- tuning the expression of individual GR target genes.

In meiner Doktorarbeit habe ich die Feinheiten der Genregulation durch den Glukokortikoidrezeptor (GR) untersucht. GR ist ein nuklearer Hormonrezeptor, welcher als Transkriptionsfaktor fungiert. Insbesondere wollte ich verstehen, welche Rolle die verschiedenen Sequenzvarianten, welche vom selben Transkriptionsfaktor gebunden werden, bei der Feinregulierung der Expression von Zielgenen spielt. In der Medizin ist GR ein wichtiges therapeutisches Zielobjekt und wurde bereits intensiv erforscht. Doch trotz unseres großen Wissens um die Wirkung von GR, verstehen wir viele Feinheiten der Genregulierung durch GR nicht im vollen Umfang. Wissenschaftler haben herausgefunden, dass die Wirkung von GR offensichtlich nicht mit der Bindungsstärke von GR an die DNS im Zusammenhang steht \cite{Meijsing2009a}. Daher wurde spekuliert, ob DNS Allosterie ein Mechanismus ist, der die Stärke der Genexpression in diesen Zusammenhang erklärt. Darüber hinaus wurden viele Studien zu GR mit klassischen Enhancer-Methoden mit niedrigen Testsequenz- Durchsatz durchgeführt. Ich dagegen nutze eine neue Technik, genannt STARR-seq (self-transcribing active regulatory region sequencing), um im Hochdurchsatz kurze synthetisierte GR-Bindungssequenzen (GBS) auf ihre quantitative Wirkung auf die GR-Genregulation zu testen. Tatsächlich fand ich heraus, dass GBS- Varianten aber auch die flankierenden Sequenzen einer GBS zur Feinregulierung durch GR beitragen. Zum Beispiel, konnte ich eine neue GBS-Variante bestimmen, welche C-reich ist und zu starker Hochregulierung von GR-Zielgenen führt. Darüber hinaus habe ich auch die Wirkung von GR im endogenen Zusammenhang untersucht. Ich konnte hierber herausstellen, dass die direkten flankierenden Sequenzen einer GBS, wenn sie A/T enthält zur starken Hochregulierung führte, während schwache Regulierung mit G/C in Verbindung stand. Der Unterschied in der Genregulierung konnte nicht durch die Bindungsstärke erklärt werden. Um den Effekt zu verstehen, welcher durch die flankierenden Sequenzen verursacht wurde, habe ich mehrere strukturelle Experimente für die DNS und das gebundene GR-Protein durchgeführt. DNS-Strukturvorhersagen zeigten, dass die DNS- Struktur der GBS durch die flankierenden Sequenzen verändert wird. Die strukturellen Experimente für GR zeigten, dass die Konformation der Dimer- Partner, die Dynamik und die relative Positionierung der Dimer-Partner durch die flankierenden Sequenzen beeinflusst wird. Aufgrund dieser Befunde, nehme ich an, dass DNS Allosterie diese unterschiedlichen GR-Strukturen verursacht hat und die Wirkung von GR beeinflusst. Im letzten Teil meiner Doktorarbeit habe ich untersucht, wie die Zell-zu-Zell Variabilität der Genexpression durch den Aufbau der GR-gebundenen Regulationsregion beeinflusst wird. Ich fand heraus, dass zum Beispiel mehrere GBSs zu einer hoher Genexpression mit viel Variabilität führt, während eine Kompositsequenz bestehend aus einer GBS mit einer Bindungsstelle für einen anderen Transkriptionsfaktors zu einer hoher Genexpression mit relativ wenig Variabilität führt. Alles in allem, konnte ich zeigen, dass GBS-Varianten die Feinregulierung der Genexpression durch GR beeinflussen und dass DNS Allosterie eine wichtige Rolle in der Feinregulierung der Genexpression zufällt.