dc.contributor.author
Uhle, Stefan
dc.date.accessioned
2018-06-07T22:19:26Z
dc.date.available
2004-09-24T00:00:00.649Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/9117
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-13316
dc.description
0\. Titelblatt und Inhaltsverzeichnis
1\. Einleitung 1
1.1. Das COP9 Signalosom 3
1.2. Die Rolle des COP9 Signalosoms im Ubiquitin/26S-Proteasom-System 4
1.3. Die Proteinkinasen PKD und CK2 14
2\. Zielsetzung 23
3\. Ergebnisse 24
3.1. Das COP9 Signalosom besitzt eine Kinaseaktivität 24
3.2. Identifizierung der Kinasen während der Komplexisolierung 26
3.3. CK2 und PKD binden an das COP9 Signalosom 30
3.4. CK2 und PKD phosphorylieren CSN-Untereinheiten, p53 und c-Jun 33
3.5. Inhibitoren der Kinasen 37
3.6. Humanes Mdm2 wird durch die CSN-assoziierten Kinasen phosphoryliert 38
3.7. Mdm2 bindet an das COP9 Signalosom 39
3.8. Curcumin induziert die Auto-Ubiquitylierung von Mdm2 42
4\. Diskussion 45
4.1. Die Kinaseaktivität des COP9 Signalosoms 45
4.2. Die CSN-assoziierten Proteinkinasen CK2 und PKD regulieren den
Proteinabbau über das Ubiquitin/26S-Proteasom-System 53
4.3. Das COP9 Signalosom beeinflusst die Aktivität der Ubiquitin-Ligase Mdm2
55
4.4. Das COP9 Signalosom als Plattform für die Bildung von
Ubiquitinkonjugaten 59
5\. Material und Methoden 63
5.1. Molekularbiologische Methoden 63
5.2. Proteinbiochemische Methoden 67
5.3. Zellkultur 77
6\. Zusammenfassung 79
7\. Referenzen 82
8\. Abkürzungen 94
9\. Appendix 97
9.1. Danksagung 97
9.2. Lebenslauf 98
9.3. Publikationen 99
dc.description.abstract
Das COP9 Signalosom (CSN) ist von Hefe bis zum Menschen konserviert und
besteht aus acht Untereinheiten (CSN1-8). Der aus humanen Erythrocyten
gereinigte CSN-Komplex besitzt Kinaseaktivität und phosphoryliert Proteine wie
c-Jun und p53 mit Konsequenzen für ihren Ubiquitin-abhängigen Abbau. In dieser
Studie konnte gezeigt werden, dass die Proteinkinase CK2 und die Proteinkinase
D (PKD) mit dem CSN-Komplex co-purifizieren. Die Bindung der beiden Kinasen an
den Komplex konnte mit Immunopräzipitationen und Far-Westernblots sowohl in
vitro als auch in Zellkultur nachgewiesen werden. Elektronenmikroskopische
Untersuchungen mit einem gold-markierten ATP-Analogon weisen darauf hin, dass
mindestens 10% der Komplexe mit Kinasen assoziiert sind. CK2 bindet an
ΔCSN3(111-403) und CSN7, während PKD nur CSN3 bindet. Die PKD ist in der Lage
CSN7 zu phosphorylieren, während die CK2 zusätzlich CSN2 phosphorylieren kann.
In Kinase-Assays konnte gezeigt werden, dass c-Jun und p53 Substrate der
beiden Kinasen sind. Durch die CK2-abhängige Phosphorylierung von p53 an
Threonin 155 wird der Tumorsuppressor verstärkt über das Ubiquitin(Ub)/26S-
Proteasom-System abgebaut. Curcumin, Emodin, DRB und Resveratrol blockieren
die Komplex-assoziierte Kinaseaktivität und hemmen sowohl die CK2 als auch die
PKD.
Das Mdm2, eine Ubiquitin-Ligase, ist für den Abbau des Tumorsuppressors p53
verantwortlich. Immunopräzipitationen, Far-Westernblots und
Immunofluoreszenzanalysen zeigen, dass das Onkoprotein an den CSN-Komplex
bindet. Darüber hinaus wird das Mdm2 am Komplex phosphoryliert,
höchstwahrscheinlich durch die CK2. Die Phosphorylierung wird dabei durch
Curcumin inhibiert. Ferner konnte sowohl in Ubiquitylierungs-Assays als auch
in MCF-7-Zellen gezeigt werden, dass Curcumin die Bildung von hochmolekularen
Mdm2-Ubiquitin-Konjugaten induziert. Basierend auf diesen Daten kann ein
Modell aufgestellt werden, in dem die Ubiquitin-Ligase Mdm2 und der p53-Abbau
durch die CSN-assoziierten Kinasen reguliert werden. Durch Hemmung der
gebundenen Kinasen wird das Mdm2 ubiquityliert, wahrscheinlich durch eine
Stimulierung der Auto-Ubiquitylierungsaktivität, und dies führt in der Folge
zu einem proteasomalen Abbau von Mdm2. Mit anderen Worten: Die
Phosphorylierung von Mdm2 hemmt die Auto-Ubiquitylierung. Das COP9 Signalosom
dient somit als Plattform für die Regulation von Ubiquitin-Ligasen und des
Proteinabbaus durch das Ubiquitin/26S-Proteasom-System.
de
dc.description.abstract
The COP9 signalosome (CSN) is conserved from yeast to man and consists of
eight subunits (CSN1-8). The purified CSN complex from human erythrocytes
possesses kinase activity that phosphorylates proteins such as c-Jun and p53
with consequences for their ubiquitin (Ub) dependent degradation. In this
study it is shown that the protein kinase CK2 and the protein kinase D (PKD)
co-purify with the CSN. The association of these kinases with the complex was
demonstrated by far-western blots and by immunoprecipitation in vitro and in
cell culture experiments. As indicated by electron microscopy with a gold-
labelled ATP-analogue, at least 10% of CSN particles are associated with
kinases. CK2 binds to ΔCSN3(111-403) and CSN7, whereas PKD interacts only with
full-length CSN3. The PKD modifies CSN7 while the CK2 also phosphorylates the
CSN2 subunit. In kinase assays both kinases phosphorylate recombinant c-Jun
and p53. The phosphorylation of p53 at Thr155 by the CK2 targets the tumour
suppressor to degradation by the Ub/26S proteasome system. Curcumin, emodin,
DRB and resveratrol block CSN-associated kinases and also inhibit the CK2 and
PKD.
The oncoprotein Mdm2, a RING finger ubiquitin ligase, is responsible for the
ubiquitylation of the tumour suppressor p53. By far-western blots,
immunoprecipitation experiments and immunofluorescence analysis it is shown
that Mdm2 binds to the CSN complex in vitro and in cell culture experiments.
Mdm2 is phosphorylated by the CSN-associated kinases, most likely by the CK2.
The phosphorylation is inhibited by curcumin. In addition, curcumin induces
the formation of high molecular weight Mdm2 ubiquitin conjugates in vitro and
in MCF-7 cells. Based on these data we propose a model in which the Ub ligase
Mdm2 and the degradation of p53 are regulated by the CSN-associated kinases.
Inhibition of the kinases causes Mdm2 ubiquitin conjugate formation, most
likely by stimulation of the auto-ubiquitylation activity, followed by the
degradation of Mdm2. In other words, the phosphorylation by the CSN-associated
kinases prevents the auto-ubiquitylation of Mdm2. Thus the COP9 signalosome
serves as a scaffolding platform that regulates ubiquitin ligases and protein
degradation via the Ub/26S proteasome system.
en
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
COP9 signalosome
dc.subject
protein kinase
dc.subject
phosphorylation
dc.subject
ubiquitylation
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie::570 Biowissenschaften; Biologie
dc.title
Identifizierung und Charakterisierung von Enzymen, die mit dem COP9 Signalosom
assoziiert sind
dc.contributor.firstReferee
Prof. Wolfgang Dubiel
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Mathias Ziegler
dc.date.accepted
2004-09-23
dc.date.embargoEnd
2004-09-27
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-2004002449
dc.title.translated
Identification and characterisation of enzymes that are associated with the
COP9 signalosome
en
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000001498
refubium.mycore.transfer
http://www.diss.fu-berlin.de/2004/244/
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000001498
dcterms.accessRights.dnb
free
dcterms.accessRights.openaire
open access