Molecular and cellular analysis of a crossreactive hsp60 specific T cell receptor in vitro and in vivo

Abstract

The goal of this work was the characterization of a TCR from a CD8+ T cell clone that crossreacted with defined epitopes of both mycobacterial and murine hsp60 and induced an autoimmune intestinal pathology. TCR analysis of this T cell clone revealed the productive in-frame rearrangement of one TCR alpha and two TCR beta genes. The question was addressed whether hsp60 crossrecognition was directly linked to the surface expression of two TCRs by the same cell or if a single TCR alpha/beta combination was sufficient for the crossrecognition of the mycobacterial and murine hsp60. Therefore, the potentially dual TCR of the hsp60 reactive T cell clone was dissected into single TCR by double retroviral transduction of TCR deficient cell lines. Our data show that only one of the two TCR alpha/beta combinations could constitute a functional cell surface TCR and that posttranslational allelic exclusion of the second alpha chain was achieved by its inability to pair with the TCR beta chain. In conclusion, a single TCR is not only sufficient for crossrecognition with peptides that share minimal sequence homology, moreover this promiscuous TCR reactivity accounts also for the immunopathology of the original T cell clone. Consequently, the rearranged alpha8 and the beta8 chain genes of the functional hsp-crossreactive single TCR were employed for the generation of TCR transgenic mice. In spite of their self-reactive potential, the alpha/beta chain double transgenic T cells were not negatively selected during thymic maturation. Like the parental T cell clone, the transgenic alpha/beta T cells displayed the CD8 T cell coreceptor and were specific for mycobacterial hsp60 peptides. So far, the TCR transgenic mice do not show any signs of autoimmune disease and the transgenic T cells were not spontaneously activated by self hsp60 peptides. Thus, the hsp specific TCR transgenic mice represent a valuable tool to study the potentially harmful activation of selfreactive T cells in vivo, e.g. by mycobacterial infection and thereby may provide new information about the link between infection and autoimmunity. In addition, using MHC class I tetrameters, the recognized mycobacterial hsp60 peptide was shown to be a relevant CD8 epitope during an immune response to mycobacterial infection. Hence, these transgenic mice may serve to study CD8+ T cell responses against mycobacterial infections. Transgenic expression of the second in-frame rearranged but non-pairing TCR alpha7 chain in TCR alpha chain deficient mice unveiled that this TCR alpha chain was generally unable to form a normal alpha/beta TCR. Surprisingly, augmented frequencies of unconventional CD4+ TCR alpha- beta+ T cells were found in these mice. This unusual CD4+ TCR alpha- beta+ T cell population is associated with the development of IBD resembling human UC in TCR alpha chain deficient mice. However, the significance of CD4+ TCR alpha- beta+ T cells in immunocompetent individuals remains unclear. We found that an in-frame rearranged but non-pairing TCR alpha chain stabilizes newly synthesized TCR beta chains in TCR alpha chain deficient mice. This lead to increased frequencies of CD4+ TCR alpha- beta+ T cells and exaggerated the course of IBD. Furthermore, it was shown that CD4+ TCR alpha- beta+ T cells are chronically activated. In this model, physiological TCR alpha chain rearrangement can promote the formation of chronically activated CD4+ TCR alpha- beta+ T cells. Thus, we conclude that these T cells are present under physiological conditions and play a role in the etiology of UC.

Ziel dieser Arbeit war die Charakterisierung des T-Zellrezeptors (TZR) eines Hsp-spezifischen CD8+ T-Zellklons, der eine autoimmune Entzündungsreaktion im Dünndarm verursacht. Diese T-Zellen, Klon UZ3/4, kreuzreagieren mit definierten Peptiden des mykobakteriellen und murinen Hsp60. Zu Beginn wurden die in dem T-Zellklon UZ3/4 rearrangierten TZR-Gene, zwei alpha und eine beta Kette, kloniert und charakterisiert. Es wurde der Frage nachgegangen, ob beide alpha Ketten mit der beta Kette einen funktionellen TZR bilden können und ein sogenannter "dualer TZR" an der Kreuzreaktivität dieser T-Zellen beteiligt ist. Die Analyse TZR defizienter Thymoma-Zelllinien, die mit den verschiedenen alpha und beta TZR Kombinationen stabil transfiziert wurden, zeigte, dass ein singulärer promisker TZR für die Peptiderkennung sowohl der mykobakteriellen als auch der murinen Hsp60 Peptide ausreicht. Obwohl die zweite TZR alpha Kette des T-Zellklons UZ3/4 im Leseraster rearrangiert war, konnte sie keinen funktionellen TZR an der Zelloberfläche exprimieren. Basierend auf diesen in vitro Befunden wurden im Rahmen dieser Arbeit verschiedene TZR-transgene Mäuse hergestellt, die den funktionellen Hsp60 spezifischen TZR (TZR alpha8 und TZR beta8 Kette) konstitutiv in ihren T-Lymphozyten exprimieren. Es zeigte sich, dass diese TZR transgenen T-Zellen trotz ihres autoreaktiven Potenzials nicht durch thymische Selektionsmechanismen deletiert werden. Wie der T-Zellklon UZ3/4 weisen diese T-Zellen die Expression des Korezeptors CD8 auf und erkennen spezifisch mykobakterielles Hsp60 Peptid. Nach dem jetzigen Stand der Untersuchungen tritt bei diesen Tieren keine spontane intestinale Autoimmunreaktion auf, d.h. die transgenen T-Zellen werden nicht allein durch die Erkennung von Peptiden des murinen Hsp60 aktiviert. Somit stellen diese Tiere ein Modell zur Untersuchung der Aktivierung potenziell autoreaktiver CD8+ T-Zellen dar. Besonders informativ ist hierbei die Frage, ob eine durch diese T-Zellen vermittelte Autoimmunreaktion durch eine mykobakterielle Infektion induziert werden kann. Weiterhin konnte mit Hilfe von MHC- Klasse-I-Tetrameren gezeigt werden, dass auch in normalen Mäusen das durch den T-Zellklon UZ3/4 erkannte Epitop im mykobakteriellen Hsp60 relevant für eine CD8+ T-Zellantwort gegen Mykobakterien ist. Deshalb eignen sich die TZR transgenen Mäuse auch generell zum Studium der CD8+ T-Zellantwort gegen Mykobakterien. Die Expression der zweiten TZR alpha Kette (TZR alpha7) des T-Zellklons UZ3/4 in den T-Lymphozyten TZR defizienter Mäuse demonstrierte, dass diese TZR Kette grundsätzlich nicht im Stande war einen normalen alpha/beta TZR zu bilden. Überraschenderweise wurde in solchen Tieren jedoch eine erhöhte Frequenz von unkonventionellen CD4+ TZR alpha- beta+ T-Zellen gefunden. Letztere T-Zellpopulation ist in TZR defizienten Mäusen für die Entstehung einer entzündlichen Dickdarmpathologie ähnlich der Ulcerativen Colitis im Menschen verantwortlich. Entsprechend ist der Krankheitsverlauf dieser Darmentzündung in Mäusen, die eine erhöhte Frequenz dieser unkonventionellen T-Zellen zeigen, schneller und stärker ausgeprägt. Interessanterweise waren die CD4+ TZR alpha- beta+ Zellen chronisch aktiviert. Die Bedeutung solcher CD4+ TZR alpha- beta+ T-Zellen in immunkompetenten Individuen ist jedoch unklar. Hier konnte gezeigt werden, dass eine nicht paarungsfähige TZR alpha Kette neu gebildete TZR beta Ketten stabilisieren und damit die Entwicklung von CD4+ TZR alpha- beta+ T-Zellen begünstigen kann. Wir vermuten daher, dass solche T-Zellen auch unter physiologischen Bedingungen vorkommen und eine Rolle in der Ätiologie der Ulcerativen Colitis spielen.