Analyse des RHO-SMOK1-Signalnetzwerkes bei der nicht-mendelschen Vererbung in der Maus

Abstract

Der t-Haplotyp der Maus (t), eine variante Form des Mauschromosoms 17, bewirkt in heterozygoten t/+-Männchen eine Verschiebung der Vererbungsrate zu seinen Gunsten. Diese nicht-mendelsche Vererbung ist das Ergebnis eines Signalweges, in dem mehrere Distorter additiv auf die Spermien-Motilitäts-Kinase, SMOK1, wirken und diese in allen Spermienzellen übermäßig stark aktivieren. Diese Hyperaktivierung wird durch die Wirkung des t-Komplex Responders, TCR, nur in den Spermienzellen normalisiert, die auch den Responder-Genlocus tragen. Die Spermien, die zusätzlich zu den Distortern auch unter dem Einfluss des Responders stehen, besitzen somit einen Vorteil, was zu einer höheren Befruchtungswahrscheinlichkeit führt. Wie dieser Vorteil genau erreicht wird, ist nicht bekannt, da bislang keine direkten Interaktionspartner oder Zielmoleküle für SMOK1 beschrieben waren. Mit Hilfe der Hefe-Zwei-Hybrid Methode konnten in dieser Arbeit sowohl Bindungspartner (Preys) für SMOK1 als auch für mehrere Distorter-Proteine identifiziert werden. Weiterführend und basierend auf einer Auswahl wurden fünf dieser Preys (Ammecr1, Akap9, Rhpn1, Spata22, Dnali1) auf ihre mRNA- und Protein-Expression im Hodengewebe und in Spermatozoen untersucht. Durch elektronenmikroskopische Studien, die den genauen Expressionsort der Prey-Proteine zeigen, konnte die Kolokalisation von TCR bzw. SMOK1 und den Preys an subzellulären Strukturen des Spermienschwanzes, wie der Fibrous Sheath und den Outer Dense Fibers, abgeleitet werden. Ein Teil der Hefe-Zwei-Hybrid Interaktionen wurde schließlich in Säugerzellen durch Interaktionsstudien wie der Lumineszenz basierten IP Analyse und der bimolekularen Fluoreszenzkomplementation, sowie der klassischen Pull-Down Untersuchung untermauert. Zusätzlich wurden neue Verknüpfungen beobachtet, die in der Hefe nicht identifiziert wurden. In einer weiteren Analyse konnte eine direkte Bindung von SMOK1 an die GTPasen RAC1 und RHOA aber nicht an CDC42 gezeigt werden. Diese Bindungen lassen vermuten, dass RAC1 und RHOA zum Teil direkt die Aktivität von SMOK1 beeinflussen könnten. Die identifizierten Protein-Protein-Interaktionen wurden abschließend in einem vergrößerten Netzwerk zusammengefasst. Sie zeigen, dass sowohl SMOK1 als auch die Distorter- und RHO-GTPasen über Scaffold-Proteine wie AKAP9 und RHPN1 an flagellären Strukturen gebunden sein können. Die direkten Bindungen von zwei der getesteten GTPasen (RAC1 und RHOA) an SMOK1, konnte die im molekularen Modell dargestellte Distorter-RHO-SMOK1 Verknüpfung erstmals bestätigen. Die Distorter-RHO-Komplexe könnten demzufolge direkten mit SMOK1 in Verbindung stehen. Zudem konnte eine Interaktion von SMOK1 mit einem Bestandteil der inneren Dyneinarme (DNALI1) beobachtet werden, die möglicherweise über einen SMOK1-AMMECR1-Komplex erreicht wird. Die Verbindung zwischen SMOK1 und DNALI1 zeigt zum ersten Mal, dass die Kinase in der Lage sein könnte am Axonem mit der Komponente eines Dyneinkomplexes zu interagieren. Durch eine gezielte Wirkung von SMOK1 am Dyneinbestandteil DNALI1 könnte diese Interaktion die Flagellenbewegung beeinflussen und somit eine gestörte Motilitätsphänotyp verursachen. Die Ergebnisse dieser Arbeit tragen somit dazu bei den Signalweg der nicht-mendelschen Vererbung in der Maus besser zu verstehen.

The t-haplotype of the mouse (t), which is a variant form of mouse chromosome 17, causes the preferred transmission of the t allele from heterozygous males (t/+). This non-Mendelian inheritance results from effects on a signalling pathway, where the presence of several distorter genes additively hyperactivate the sperm motility kinase, SMOK1, in the whole sperm population. This hyperactivation is balanced by the t-complex responder, TCR, only in spermatozoa carrying the responder gene. Spermatozoa influenced by the distorters and by the responder have a motility advantage, resulting in a higher probability for fertilization. It is still unclear how this advantage is manifested, as no interaction partners or targets are yet known for SMOK1. New binding partners for SMOK1 and for the distorters were identified in this study using the yeast two-hybrid method. Based on selection criteria, five prey candidate genes (Ammecr1, Akap9, Rhpn1, Spata22, Dnali1) were tested for mRNA and protein expression in testis and spermatozoa, respectively. The co- localization of SMOK1 or TCR with the prey proteins could be deduced within subcellular structures, such as the fibrous sheath and the outer dense fibers of the sperm flagellum, using electron microscopy. The protein-protein interactions identified by yeast two-hybrid were, in part, verified in a mammalian system using a luminescence-based immunoprecipitation analysis and a bimolecular fluorescence complementation assay, as well as classical pull-down studies. In addition, new protein-protein interactions were observed, which were not identified by the yeast two-hybrid analysis. Further studies revealed the direct interaction between SMOK1 and the GTPases RAC1 and RHOA, but not CDC42. This evidence gives rise to the idea that the GTPases RAC1 and RHOA are able to modify SMOK1 activity by binding to it directly. Finally, the identified protein-protein interactions were summarized in an interaction network. The interaction studies showed that SMOK1, as well the distorters and RHO proteins, are bound to flagella via scaffolding proteins like AKAP9 or RHPN1. Furthermore, the direct binding of two GTPases (RAC1 and RHOA) to SMOK1 confirm the link between distorters, RHO-proteins and SMOK1, which is predicted by the molecular model of TRD. The novel interaction of SMOK1 to a component of the inner dynein arms (DNALI1) was additionally observed. This interaction could potentially be generated by a SMOK1-AMMECR1 complex. The specific modification of DNALI1 by SMOK1 could negatively affect the movement of the sperm flagellum, and therefore generate the motility phenotype, leading to non- Mendelian inheritance in males. In summary, the results of these studies clarify our understanding of the signalling pathway leading to non-Mendelian inheritance of the t-haplotype.