Herstellung und Charakterisierung rekombinanter equiner Interferone: Expressionsklonierung, Darstellung der Proteine und der biologischen Aktivität

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurden rekombinante equine Interferone (rec.eqIFN) in verschiedenen Vektorsystemen exprimiert, ihre antivirale Aktivität bestimmt und ihre Proteine dargestellt.

Aus bekannten Sequenzen (Plasmiden), wurde der kodierende Bereich der DNA zunächst in einen pro- und eukaryotischen Expressionsvektor (pBK CMV) verbracht. Im eukaryotischen System konnte biologische Aktivität nachgewiesen werden, jedoch war diese sehr gering. Im prokaryotischen System gelang für rec.eqIFN-a und für rec.eqIFN-b sowohl auf Proteinbasis als auch in bioaktiver Form ein Nachweis. IFN-a wurde in verschiedenen Bioassays zur Bestimmung der antiviralen Aktivität und der Sensivität verschiedener Zellen (ED, EEL, MDBK) und verschiedener equiner Viren (EHV, VSV, Rhino, Borna) eingesetzt. Von weiteren Vektoren, die zum Einsatz kamen, erwies sich einer (pMAl c2) als ungeeignet. Weiterhin erfolgte die Klonierung von IFN-a in den prokaryotischen Vektor pASK IBA2, der mit dem Strep-tag-System arbeitet. Hauptsächlich konnte nur unlösliches Protein gewonnen werden. Nach Aufspaltung von Einschlußkörperchen und Aufreinigung des IFN-Proteins mit der Strep-tag-Säule gelang eine Darstellung des Proteins mittels SDS-PAGE. Mit einem dritten Vektor (pBAD gIII) gelang eine wesentliche Steigerung der Expression von IFN-a um mehrere Potenzen und die Darstellung der IFN-a - und IFN-b -Proteine mittels SDS-PAGE. Durch Immunisierung von Mäusen konnten Antikörper gegen IFN-b hergestellt und Proteine im Westernblot nachgewiesen werden.

Nachdem die Expression von rekombinanten Typ-I-Interferonen optimiert wurde, ist ein späterer klinischer bzw. diagnostischer Einsatz möglich.

In this thesis rec.eqIFN were expressed in several vector systems. The antiviral activity was determined and the proteins displayed.

The coding part of the IFN-DNA was cloned in a pro- and eucaryotic vector system (pBK CMV). In the eucaryotic system, biological activity was shown only to a very low extend. In the procaryotic system rec.eqIFN-a and rec.eqIFN-b were detected on protein basis and in the bioactive form. In different bioassays with rec.eqIFN-a the antiviral activity and sensitivity of different cells (ED, EEL, MDBK) and different equine viruses (EHV, VSV, RHINO, BDV) were determined. One of the next vectors (pMal c2) was not suitable for IFN-expression. Furthermore rec.eqIFN-a was cloned in the procaryotic vector pASK IBA2, that uses the Strep-tag-system. Principally it was only possible to get unsoluble protein. After splitting the inclusion bodies and purification of the IFN- protein with the Strep-tag-column the protein could be demonstrated by means of SDS-PAGE. With the third vector (pBAD gIII) an essential enhancement of the antiviral activity of rec.eqIFN-a and -b -proteins by several fold was achieved. After immunization of mice it was possible to produce antibodies against rec.eqIFN-b and to show the proteins in western-blot.

After optimizing the expression, interferons can be used for clinical therapy or for diagnostic use.