In vitro Charakterisierung der tumor-lytischen Wirkung des Aplysia punctata ink toxins (APIT) auf humane Tumorzellen und Etablierung eines Xenotransplantat-Modells als Basis für in vivo Analysen von APIT

Abstract

Tumorerkrankungen sind nach den Herz-Kreislauferkrankungen die zweithäufigste Todesursache in Europa. Neben Operation und Strahlentherapie ist bei der Behandlung von Tumoren die Chemotherapie das Mittel der Wahl. Klassische Tumortherapien sind jedoch häufig reich an Nebenwirkungen und oftmals erfolglos, da Therapieresistenzen eine immer größere Rolle spielen. Deswegen wird in der Onkologie weiter nach neuen, spezifischen und effektiveren Medikamenten für die Behandlung von Tumoren geforscht. Gerade bei der Suche nach potenten wirksamen Substanzen werden zunehmend marine Organismen berücksichtigt. Die Meeresnacktschnecke Aplysia punctata produziert Tinte zur Abwehr ihrer natürlichen Feinde. Ein 60 kDa großes Protein dieser Tinte, das sogenannte APIT (Aplysia punctata ink toxin) wurde am Max-Planck Institut für Infektionskrankheiten in der Abteilung Molekulare Biologie aufgereinigt und auf seine tumorizide Wirkung untersucht. In der vorliegenden Arbeit wurde die Empfindlichkeit verschiedener humaner Tumorzelllinien in vitro gegenüber dem neuen potentiellem Therapeutikum APIT untersucht. Dies erfolgte an einer Auswahl repräsentativer Tumorzelllinien, unter anderem an Lungen-, Brust-, Prostata- und Kolonkarzinom sowie an Leukämie und einigen anderen zum Teil schwer therapierbaren Krebserkrankungen. APIT löst unter in vitro Bedingungen den Tod aller getesteten Tumorzellen aus. Sowohl Tumorzelllinien des blutbildenden Systems (Jurkat neo, CEM neo, K562) als auch Tumorzelllinien aus soliden Tumoren (GLC 4, MCF7, SK-BR-3, PC3, DU145, HT29, RD-ES und A673) werden durch die APIT induzierte Wirkung erfolgreich abgetötet. Besonders vielversprechend ist die Reaktion der chemotherapieresistenten Zelllinien (GLC4/ADR und MCF7Bcl-XL). Es konnte gezeigt werden, dass die benötigte APITKonzentration wahrscheinlich von der Größe der Zelle einer Zelllinie abhängt und in einem Bereich zwischen 3 und 12 ng/ml für alle in dieser Arbeit getesteten Zelllinien liegt. Morphologisch zeigen die mit APIT behandelten Zellen auffällige Veränderungen: adhärente Zellen verlieren ihre Fortsätze und lösen sie sich von Nachbarzellen ab, Suspensionszellen liegen einzeln und nicht mehr in Kolonien vor. Es kommt bei beiden Zelltypen zu Vakuolenbildung im Zytoplasma und zum vollständigen Stillstand der intrazellulären Plasma- und Organellenbewegung. Der Zelltod ist zudem durch einen schnellen Verlust der Stoffwechselaktivität und der Permeabilisierung der Zellmembran gekennzeichnet. Um die Wirksamkeit von APIT in vivo zu überprüfen wurden Xenotransplantatmodelle etabliert. Dazu wurden verschiedene, in vitro als APIT-empfindlich getestete Tumorzelllinien subkutan in bestrahlte, immundefiziente Mäuse injiziert. Nach Festlegung von Parametern, die die erfolgreiche Etablierung eines subkutanen Tumors definieren, konnte für alle getesteten Tumorzelllinien eine zu injizierende Zellzahl von 1 x 107 Zellen evaluiert werden. In dieser Arbeit konnten für die Leukämie-Zelllinie CEM neo, die Lungenkarzinomzelllinie GLC 4 und deren chemotherapieresistente Subform GLC 4/ADR (MDR) sowie das Rhabdomyosarkom A673 und die Darmkrebszelllinien HT29 erfolgreich Xenotransplantat-Modelle mit einer Anwachsrate von mindestens 80 % etabliert werden. Mit Hilfe der in dieser Arbeit etablierten fünf Tumor- Maus-Modellen werden in Zukunft weiterführende Untersuchungen der tumoriziden Wirkung von APIT unter physiologischen Bedingungen möglich sein.

In vitro characterization of Aplysia punctata ink toxin (APIT) for its anti- cancer efficacy against human cancer cell lines and establishment of xenograft models for in vivo analyzing of APIT The increasing number of patients suffering from different forms of cancer remains a major health problem in industrialized countries. Although commonly used as standard treatment options, surgery, radiation and classical chemotherapy often result in severe adverse reactions, or are even unsuccessful due to the emerging problem of resistance linked to various drugs. For this reason, oncology research is focused on the search for novel drugs which are highly specific and efficacious. In the last decade in particular, substances isolated from marine organisms have been considered for their anti-tumor activity. The purple ink of the sea hare Aplysia punctata acts as an effective defense mechanism against natural predators. An active component of this ink, the 60 kDa A. punctata ink toxin (APIT) protein was isolated and subsequently analyzed for its cytotoxic activity. The aim of this work was to develop appropriate in vivo and in vitro model systems to evaluate the pharmacokinetics and cytotoxic/anti tumor activity of APIT. First the efficacy of this novel drug was assessed in vitro against various human cancer cell lines representing not only the most prevalent forms of cancer including lung, breast, prostate and colon carcinoma, but also different forms of leukemia and various treatment resistant cancer types. In cell culture experiments all tested cell lines were shown to be highly sensitive to APIT. Both cancer cells of the hematopoietic system (Jurkat neo, CEM neo and K562) and cell lines representing solid tumors (GLC4, MCF7, SK-BR-3, PC3, DU145, HT29, RD-Es and A673) were efficiently killed by the cytotoxic activity of APIT. Very encouraging results were also obtained for the resistant cell lines GLC4/ADR and MCF7Bcl-XL. The concentration of APIT required to kill 50% of cells (inhibitory concentration-IC50) correlated well with the size of the cells and ranged between 3 and 12 ng/ml. Cells treated with APIT exhibit characteristic morphologies: adherent cell types lose their appendices and subsequently detach from neighboring cells, cells in suspension no form longer colonies, but exist individually instead. Both cell types were found to form vacuoles in their cytoplasm and exhibit an arrest in intracellular plasma and organelle movement. The additional/subsequent loss of metabolic activity and permeablization of the cell membrane ultimately lead to cell death. In order to examine the efficacy of APIT in vivo murine xenograft models were established. For this purpose, various cancer cell lines shown to be sensitive for APIT s cytotoxic activity in vitro were injected subcutaneously into irradiated immuno deficient mice. After defining suitable experimental parameters, a cell concentration of 1 x 107 cancer cells was found to be ideal to successfully establish subcutaneous tumors in the xenograft models. Xenograft models were implemented for the leukemia cell line CEM neo, the lung carcinoma cell line GLC4 and its multidrug resistant phenotype GLC4/ADR, for the colon carcinoma cell line HT29 and the sarcoma cell line A673, all of them exhibited a growth rate of at least 80%. The xenograft models established in this work has laid the foundations for future systematic investigations on the anti-tumor activity of APIT.