Bedeutung der Sphingosin-1-Phosphat-Rezeptoren in der Regulation der Apoptose und Proliferation humaner Keratinozyten

Abstract

Für die Aufrechterhaltung der epidermalen Homöostase ist das Gleichgewicht zwischen Proliferation und Apoptose von entscheidender Bedeutung. Eine Beeinflussung dieser Prozesse in Keratinozyten ist von besonderem Interesse, da hyperproliferative Erkrankungen der Haut wie Psoriasis vulgaris durch eine Deregulation dieses Gleichgewichtes gekennzeichnet sind. Das Lysosphingolipid Sphingosin-1-phosphat (S1P) wurde lange Zeit als blosse Strukturkomponente der Lipiddoppelmembran unterschätzt. Jedoch vermittelt S1P ähnliche zelluläre Effekte wie Wachstumsfaktoren und reguliert Angiogenese, Zellmotilität, Zytoprotektion und Umstrukturierung des Zytoskeletts. Auf diese Weise werden auch zelluläre Prozesse in der Haut durch S1P beeinflusst. Eine antiproliferative und antiapoptotische Wirkung des S1P konnte in humanen Keratinozyten gezeigt werden, doch sind die zugrunde liegenden Signalwege bisher nicht charakterisiert worden. Im Rahmen dieser Arbeit konnte erstmals eine Beeinflussung der Insulin-vermittelten Signalwege durch S1P gezeigt werden, welche bei hyperproliferativen Erkrankungen der Haut pathologisch überaktiviert sind. Das Wachstum der Zellen wird entscheidend durch die Serin- Threonin Kinase Akt bestimmt. In der vorliegenden Arbeit wurde nachgewiesen, dass die proliferationshemmende Wirkung des S1P über eine Hemmung der Akt Kinase vermittelt wird. Auf diese Weise vermittelte S1P eine Reduktion der starken mitogenen Wirkung des Insulins. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass die Hemmung der Insulin-induzierten Akt Phosphorylierung durch eine Aktivierung der Proteinkinase C (PKC) delta vermittelt wird. S1P vermittelt seine Wirkungen vornehmlich über seine membranständigen G-Protein gekoppelten Rezeptoren S1P1-5. Es konnte im Rahmen dieser Arbeit eine Beteiligung des S1P2 Rezeptors an der Hemmung der Akt Kinase, der Hemmung der mitogenen Insulinwirkung und der Aktivierung der PKC delta gezeigt werden. Daraus resultierte eine Abgrenzung der zellulären Effekte des S1P vom S1P Rezeptoragonisten FTY720, der keine agonistische Wirkung am S1P2 Rezeptorsubtyp besitzt. Die phosphorylierte Wirkform des FTY720 rief keine Beeinflussung der Akt Phosphorylierung und der Proliferation hervor. Eine derartige Interaktion von S1P mit Insulin-vermittelten Signalwegen führte darüber hinaus auch zu einer Modulation der antiapoptotischen Wirkung des Insulins. Da die Akt Kinase entscheidend an der Transduktion antiapoptotischer Signale beteiligt ist, hatte die Dephosphorylierung der Insulin-induzierten Akt Kinase eine Reduktion der zytoprotektiven Wirkung des Insulins durch S1P zur Folge. Es konnte gezeigt werden, dass auch diese Interaktion durch die Aktivierung des S1P2 Rezeptors vermittelt wird. S1P selbst schützt Keratinozyten auf einem Akt-unabhängigen Signalweg vor Apoptose. Die Charakterisierung der Signalwege, über welche S1P eine Zytoprotektion der Keratinozyten vermittelt, zeigte eine Beteiligung der S1P Rezeptoren. So konnte der S1P3 Rezeptor als der Subtyp identifiziert werden, der antiapoptotische Signalwege aktiviert. Darüber hinaus konnte eine NO- Abhängigkeit der zytoprotektiven Signalwege des S1P über eine eNOS Aktivierung gezeigt werden.

The balance between proliferation and apoptosis plays a crucial role in the maintenance of epidermal homeostasis. As hyperproliferative skin diseases such as psoriasis vularis are characterized through dysregulated cell growth and survival, it was of great interest to evaluate the regulation of proliferation and apoptosis in human keratinocytes. The lysophospholipid sphingosin 1-phosphate (S1P), for long time considered only as a structural component of the membrane bilayer, has been identified as an interesting lipid mediator showing cellular effects comparable to those of growth factors. Hence, S1P influences a variety of biological processes, including angiogenesis, cell motility, cell survival and reorganisation of the cytoskeleton. Moreover, this lysophospholipid regulates cellular signaling in the skin. Antiproliferative and antiapoptotic effects have been described in human keratinocytes, but the underlying signaling pathways have never been characterized. The serine threonine kinase Akt has been identified as a major regulator of keratinocyte growth. The present study reveals that the growth inhibitory effect of S1P is mediated through an inhibition of Akt activity. In this study, a previously unreported interplay between S1P and insulin-mediated signaling pathways was identified, which is of great interest as epidermal hyperproliferation is associated with a strong induction of insulin-mediated signal transduction pathways. Most interestingly, the inhibition of insulin-induced Akt activity is mediated through protein kinase C (PKC) delta activation. S1P mediates most of its action via transmembrane G protein coupled receptors S1P1-5. This study identified the S1P2 receptor as the crucial receptor subtype for inhibition of Akt phosphorylation. Moreover, the S1P2 receptor subtype transduced the activation of PKC delta, dephosphorylation of Akt and subsequent inhibition of insulin-induced keratinocyte growth. Phosphorylated FTY720 acts as potent agonist on four S1P receptors showing no agonistic activity at the S1P2 receptor subtype. Therefore FTY720-P failed to suppress insulin-mediated Akt phosphorylation and subsequent proliferation of human keratinocytes. The present study identifies an interplay between insulin and S1P on Akt signaling leading not only to the described inhibition of insulin-induced cell growth, but also to a modulation of the antiapoptotic action of insulin. As Akt plays a crucial role in antiapoptotic signaling, the effect of S1P on insulin- mediated cytoprotection was evaluated. Indeed, dephosphorylation of Akt through S1P also reduced the antiapoptotic effect of insulin. This interplay`s effect on cytoprotective signaling was also mediated through the S1P2 receptor subtype. S1P mediates antiapoptotic signaling via distinct, Akt-independent transduction pathways. Characterization of the signaling pathways transducing the antiapoptotic effect of S1P revealed an involvement of the S1P3 receptor. Moreover, the present study shows that the antiapoptotic effect of S1P was NO dependent via eNOS activation.