Electrical excitability and mechanosensitive currents in sensory neurons: developmental onset, calcium channels and NGF-mediated modulation of mechanotransduction

Abstract

The mechanotransduction process utilized by auditory/vestibular system and somatosensory system is broadly viewed as a two-stage process: mechanical stimuli open the mechanosensitive ion channels, generating a RP, which is encoded into APs by voltage sensitive ion channels. The mechanosensitivity of cutaneous and deep tissue mechanoreceptors is profoundly affected by unidentified mechanosenstive ion channel at the first stage and interplay of various voltage-gated ion channels at the second stage. The contribution of these two types of ion channels underlying target dependent sensitivity and mechanical sensitization has not been adequately studied. In the present study, we took a well-established mouse DRG culture as a model to study the mechanotransduction processes. By using the whole cell patch-clamp technique, three types of mechanosensitive currents are evoked by stimulating the cell soma or neurite with a nanomotor. In the first part of this study, we showed that the two processes involved in somatosensory mechanotransduction are sequentially acquired during development. The electrical excitability of DRG neurons is acquired prior to the mechanosensitivity and characteristic electrical excitabilities of mechanoreceptors and nociceptors are fine tuned during the whole developmental stages. As to mechanosensitivity, the RA type mechanosensitive current is gained by most DRG neurons at E13.5, which is correlated with the peripheral target innervation, whereas neurons with SA type current only appear later at E16.5 and reach in significant number at birth. Therefore, the highly regulated appearance of mechanosensitive currents in vitro allowed us to screen candidate genes involved in mechanotransduction, whose expression profile matches mechanosensitive current appearance. Cav3.2 is a low voltage activated calcium ion channel, which has been found highly expressed in subtypes of DRG neurons. Our lab showed that it is enriched in the most sensitive cutaneous mechanoreceptors, D-hairs, and may be required for the normal D-hair mechanosensitivity. However, Cav3.2 is also implicated in nociception by pharmacological and behavior studies from other groups. In the second part of the work, I used an in vitro skin nerve preparation to investigate the function of Cav3.2 in mechanosensitivity of all cutaneous mechanoreceptors by using Cav3.2-/- mice. Our results showed that only the mechanosensitivity of D-hair was dramatically reduced in mutant mice. In addition the mechanical latency of both rapidly adapting mechanoreceptors (D-hair and RAM) was delayed. Further experiments with patch-clamp technique showed that the properties of the receptor current were unaltered in mutant mechanoreceptors. Although we did not provide the direct evidence that the lack of Cav3.2 elevated the threshold of AP generation, from the above experiments we could conclude that the reduced mechanosensitivity in Cav3.2-/- mice was caused by delayed AP initiation due to the lack of Cav3.2. In the third part of my study, we combined retrograde labeling with patch-clamp techniques to investigate the contribution of ion channels involved in two stages of mechanotransduction to target dependent mechanosensitivity. Here we found that differences in mechanosensitivity from skin and deep tissue (gastrocnemius-soleus muscle in this particular case) under normal conditions is attributable mainly to the silence or the lack of unidentified mechanosensitive ion channels in muscle afferent neurons rather than the AP generation level controlled by voltage-gated ion channels. Furthermore, the algesic drug, NGF modulated the mechanosensitivity at both mechanotransduction sites under inflammatory conditions. But the signaling pathway underlying the mechanical sensitization induced by NGF has to be further unraveled. In conclusion, our work provides for the first time direct evidence that the mechanotransduction is a two-stage developmental process, that the mechanosensitivity of different mechanoreceptors could be endowed by ion channels involved at any level of the transduction process. Finally, inflammatory mediators can modulate the mechansensitivity from both processes.

Der Mechanotransduktionsprozess des auditären/vestibulären Systems and des somato-sensorischen Systems wird allgemein als zwei-Stufen Prozess angesehen. Mechanische Stimuli öffnen mechanosensitive Inonenkanäle und generieren ein RP, welches durch spannungsabhängige Inonenkanäle in APs kodiert wird. Die Sensibilität der kutanen Mechanorezeptoren und Mechanorezeptoren des tieferliegenden Gewebes wird auf der ersten Stufe von unbekannten mechanosensitiven Ionenkanälen, und auf der zweiten Stufe durch ein Wechselspiel unterschiedlicher spannungsabhängiger Ionenkanäle hochgradig beeinflusst. Die Beteiligung dieser beiden Kanaltypen bezüglich der gewebspezifischen mechanischen Sensibilisierung wurde bisher kaum untersucht. In der vorliegenden Arbeit verwendeten wir ein etabliertes Maus DRG Zellkultur-Modell um den Mechanotransduktionsprozess zu untersuchen. Durch vorhergehende Arbeiten mittels der whole-cell patch clamp Methode ist bekannt, dass ducrh mechanische Stimulation des Zellsomas oder der Neuriten durch einen Nanomotor drei unterschiedliche Typen an Strömen erzeugt werden. Im ersten Teil dieser Arbeit konnten wir zeigen, dass die beiden an somatosensorischer Mechanotransduktion beteiligten Prozesse während der embryonalen Entwicklung sequentiell erworben werden. Die elektrische Erregbarkeit von DRG Neuronen wird vor der Mechanosensisitivität erworben, und die charakteristische elektrische Erregbarkeit wird während aller Entwicklungsstadien abgestimmt. Die meisten DRG Neurone erhalten den mechanosensitive Strom des RA-Typs zum Embryonalstadium E13.5, was mit der Innervation peripheren Gewebes einhergeht, während der Strom des SA-Typs bei E16.5 erscheint und erst bei der Geburt eine signifikante Anzahl erreicht. Die streng regulierte Erscheinung mechanosensitiver Ströme in vitro ermöglichte es uns, mögliche an der Mechanotransduktion beteiligten Gene, deren Expressionsprofil mit dem Vorkommen mechanosensitiver Ströme übereinstimmt, zu screenen. Cav3.2 ist ein spannungsaktivierter Kalzium-Ionenkanal, der in Subtypen von DRG Neuronen stark exprimiert wird. In unserem Labor konnte gezeigt werden, dass er in den sensitivsten cutanen Mechanorezeptoren, den D-hairs, angereichert ist, und er könnte für die normale D-hair Mechanosensitivität notwendig sein. Andere Arbeitsgruppen zeigten durch pharmakologische Versuche und Verhaltensexperimente, dass Cav3.2 auch bei der Schmerzempfindung eine Rolle zu spielen scheint. Im zweiten Teil dieser Arbeit führten wir in vitro Experimente mittels Haut-Nerv-Preparationen an Cav3.2-/--Mäusen durch, um die Funktion von Cav3.2 bei der Mechanosensitivität aller cutanen Mechanorezeptoren zu untersuchen. Wir beobachteten, dass die Mechanosensitivität bei Cav3.2-/--Mäusen nur in D-Hairs signifikant reduziert war. Ausserdem war die mechanische Latenzzeit beider “rapidly-adapting” Mechanorezeptoren (D-Hair und RAM) verlängert. Anhand der Patch Clamp Methode konnten wir zeigen, dass die Eigenschaften des Rezeptorstromes in Cav3.2-/--Mäusen unverändert blieb. Auch wenn wir nicht den direkten Beweis dafür erbrachten, dass das Fehlen von Cav3.2 zu einer Erhöhung des Grenzwertes zur AP Generierung führt, so können wir dennoch aus obigen Ergebnissen schliessen, dass die reduzierte Mechanosensitivität in Cav3.2-/--Mäusen durch eine verspätete AP Initiierung mangels Cav3.2 verursacht wird. Im dritten Teil dieser Arbeit kombinierten wir retrograde Markierungs-Experimente mit der Patch Clamp Methode, um die Beteiligung von an beiden Stufen der Mechanotransduktion involvierten Ionenkanälen bezüglich gewebspezifischer Mechanosensitivität zu untersuchen. Wir konnten zeigen, dass unter Normalbedingungen Unterschiede bezüglich der Mechanosensitivität der Haut and des teferliegenden Gewebes (hier: gastrocnemius-soleus-Muskel) hauptsächlich der nicht-Aktivierung oder den Mangel an unidentifizierten machanosensitiven Ionenkanälen in den Muskel innervierenden Neuronen, und weniger der durch spannungsabhängige Ionenkanäle kontrollierten AP Generation zuzuordnen ist. Ausserdem beobachteten wir, dass NGF unter inflammatorischen Bedingungen die Mechanosensitivität von sowohl Mechanorezeptoren der Haut als auch des tieferliegenden Gewebes moduliert. Der dieser Sensitivierung zugrundeliegende und durch NGF induzierte Signalweg sollte weiter untersucht werden. Diese Arbeit liefert den ersten direkten Beweis dafür, dass Mechanotransduktion ein zwei-stufiger Entwicklungsprozess ist und dass die Mechanosensitivität unterschiedlicher Mechanorezeptoren an jeder Stelle des Transduktionsprozesses durch beteiligte Ionenkanäle erbracht wird. Schliesslich wurde gezeigt, dass inflammatorische Mediatoren die Mechanosensitivität beider Prozesses modulieren.