Die cytoplasmatische Sequenz der α1-Integrinuntereinheit: Analyse der Lipidbindung, der Struktur und des Signalkomplexes mit Phospholipase Cγ1 im Rahmen der α1β1-Integrin-vermittelten Signaltransduktion

Abstract

Das α1β1-Integrin ist ein die Plasmamembran durchspannender Adhäsionsrezeptor, der nach Bindung an den extrazellulären Liganden Kollagen intrazelluläre Signalwege auslöst, die zu Zelladhäsion, -spreitung, -migration und -proliferation führen. Gemeinhin wird die Hauptrolle in der α1β1-Integrin vermittelten intrazellulären Signaltransduktion der cytoplasmatischen Domäne der β1- Integrinuntereinheit zugesprochen. Zunehmend demonstrieren Studien jedoch auch die signalgebende Bedeutung der kurzen α1-cytoplasmatischen Sequenz (α1-CS), welche die Aminosäuren KIGFFKRPLKKKMEK umfasst. Auf welchem Weg der α1-cytoplasmatische Teil seine Signalfunktion entfaltet, ist allerdings nur wenig erforscht. In der vorliegenden Arbeit wurden deshalb sowohl die Struktur als auch die Lipidbindung als mögliche funktionsdeterminierende Eigenschaften dieser kurzen, basischen Sequenz untersucht. Das von der α1-CS abgeleitete Peptid besaß in Lösung keine definierte Sekundärstruktur, wie CD-Messungen und MD-Simulationen zeigten. Die erstmals für ein Integrin durchgeführten Lipidbindungsstudien demonstrierten jedoch, dass die α1-CS mit den Second messenger Molekülen PI(4,5)P2 und insbesondere PI(3,4,5)P3 assoziierte. Für diese Interaktionen konnten mikromolare Dissoziationskonstanten ermittelt werden, die für eine geringe Bindungsaffinität sprechen. Das Peptid der α1-CS inserierte zudem in Abhängigkeit von der PIP-Art und der PIP-Konzentration und vermittelt über ionische Wechselwirkungen in PI(4,5)P2\- und PI(3,4,5)P3-enthaltende Langmuir- Filme. Studien mit verkürzten Peptiden ergaben, dass die Membraninsertion der α1-CS durch das membranproximale, konservierte KIGFFKR-Motiv angetrieben, durch die membrandistale, α1-spezifische PLKKKMEK-Sequenz jedoch stabilisiert und verstärkt wurde. Die Assoziation mit Liposomen, die PI(4,5)P2 oder PI(3,4,5)P3 enthielten, induzierte keine eindeutige Sekundärstruktur in den α1-Integrinpeptiden, jedoch liefert die vorliegende Arbeit Hinweise darauf, dass die Interaktion zwischen α1β1-Integrin und dem phospholipidmodifizierenden Enzym PLCγ1 durch PI(4,5)P2 bzw. PI(3,4,5)P3 verstärkt wird. Dabei wurden die PH- und die C-SH2-Domäne der PLCγ1 als Bindungsloci für die cytoplasmatischen Domänen von α1- und β1-Integrinuntereinheit identifiziert. Die Assoziation beider Integrinketten mit der PH-Domäne war hierbei von deren Lipidbindung und der Ionenstärke abhängig. In funktionellen Studien wurde weiterhin die Bedeutung sowohl der PLCγ1 als auch ihrer PH-Domäne für die α1β1-Integrin-vermittelte Zellmigration gezeigt. Immuncytochemische Studien demonstrierten die Rolle der PH- bzw. der C-SH2-Domäne in der α1β1-Integrin-vermittelten, regulierten Ausbildung von Membranausläufern und der Organisation des Aktincytoskeletts. In Abhängigkeit von der β1-cytoplasmatischen Domäne co-lokalisierte die N+C-SH2-Domäne der PLCγ1 zudem mit den Enden kortikaler Aktinstränge. Diese Befunde weisen auf die Bedeutung kooperativer Protein-Protein- und Protein-Lipid-Interaktionen zwischen α1β1-Integrin, Phosphoinositiden und der PLCγ1 für die α1β1-Integrin- abhängige, PLCγ1-vermittelte Zellmigration hin. Die zur Lipidbindung der α1-CS vorgestellten Daten eröffnen zudem einen neuartigen Regulierungsmechanismus der α1β1-Integrin-vermittelten Signaltransduktion, der generell für Integrine gelten könnte.

α1β1 Integrin is a membrane-spanning cell adhesion receptor. Upon binding to its extracellular ligand collagen, α1β1 integrin initiates intracellular signalling pathways, which enable cell adhesion, spreading, migration and proliferation. The cytoplasmic domain of the β1 integrin subunit is commonly considered to play the major role in α1β1 integrin-mediated intracellular signal transduction. Yet, there is growing evidence on the signalling properties of the short α1 cytoplasmic sequence (α1-CS), which comprises the 15 amino acids KIGFFKRPLKKKMEK. Little is known about the signalling mechanisms of the α1 cytoplasmic tail. Therefore, within the scope of this thesis, the structure as well as the lipid binding of this short, positively charged sequence have been investigated as potential function-underlying features of the α1-CS. CD spectroscopy and MD simulations revealed that the peptide derived from the α1-CS did not adopt any secondary structure in solution. However, lipid binding studies, which have been performed for integrins for the first time, demonstrated that the α1-CS bound to the second messenger molecules PI(4,5)P2 and particularly PI(3,4,5)P3. Micromolar dissociation constants were determined for this lipid-peptide interaction, arguing for its low binding affinity. Moreover, the peptide of the α1-CS inserted into Langmuir films which contained PI(4,5)P2 or PI(3,4,5)P3. Membrane insertion of the peptide was realised by ionic interactions and was dependent on the species and the concentration of the applied phosphoinositide. Studies with truncated peptides revealed that membrane insertion of the α1-CS was driven by its membrane-proximal, conserved KIGFFKR motif, however stabilised and accomplished by the membrane-distal, α1-specific PLKKKMEK sequence. Thus, for the first time ever, binding of an integrin to PI(4,5)P2 and PI(3,4,5)P3 has been shown in this work. Association with liposomes containing PI(4,5)P2 or PI(3,4,5)P3 did not evoke any clear conformational change of the integrin peptides. Yet, this work provides evidence, that the interaction between α1β1 integrin and the phospholipid- modifying enzyme PLCγ1 is stimulated by PI(4,5)P2 or PI(3,4,5)P3. Beyond, both the PH and the C-SH2 domain of PLCγ1 were mapped as binding sites for the α1 and β1 cytoplasmatic sequences. Thereby, the association of the integrin with the PH domain was dependent on both the lipid binding of the latter and the ionic strength. By means of functional assays, it was shown that PLCγ1 as well as its PH domain is involved in α1β1 integrin-mediated cell migration. Furthermore, immunofluorescence studies demonstrated the role of the PH and the C-SH2 domain in the regulated formation of membrane protrusions as well as in the assembly of the actin cytoskeleton, upon collagen ligation of α1β1 integrin. Additionally, dependent on the β1 cytoplasmic sequence, the N+C-SH2 domain of PLCγ1 was localised at the ends of cortical actin strands. These results point at the important role that cooperative protein-protein and protein-lipid interactions between α1β1 integrin, phosphoinositides and PLCγ1 might play in α1β1 integrin-dependent and PLCγ1-mediated cell migration. Eventually, the provided data on the lipid binding features of the α1-CS reveal a novel mode of regulation for the α1β1 integrin-mediated signal transduction, which might be universally valid for all integrins.