Untersuchungen zum nichtviralen Gentransfer mittels integrierender und extrachromosomal-replikationskompetenter Plasmid-DNA in hämatopoetische Zellen

Abstract

Das Ziel dieser Dissertation bestand in der Optimierung des nichtviralen Gentransfers insbesondere in hämatopoetische Zellen. Hierbei sollte eine möglichst hohe Transfektionseffizienz und damit hohe Transgenexpression, sowie stabile Transgenexpression erzielt werden. Die systematische Untersuchung eines Plasmid-DNA-Dimers im Vergleich mit dessen Monomer ergab deutliche Unterschiede bezüglich intrazellulärer Verteilung und Transgenexpression nach Transfektion. Bei Transfektion äquimolarer Mengen an Genkopien ergab sich bezüglich der Höhe der Transgenexpression der transfizierten Zellen kein Unterschied. Interessanterweise konnte nach Transfektion äquimolarer Mengen an Plasmid-DNA-Molekülen höhere Transgenexpression in den Zellen beobachtet werden, die mit dem Dimer transfiziert wurden. Im Weiteren wurde die intrazelluläre Lokalisation der Konkatemere nach Transfektion untersucht. Im Zusammenhang mit den relativen Mengen der jeweiligen Konstrukte im Zellkern und der zuvor bestimmten Transgenexpression ließ sich die relative Transkriptionseffizienz der beiden Konstrukte berechnen. Interessanterweise vermittelte das dimere Plasmid-DNA-Molekül mit 3,5-fach höherer Effektivität Transgenexpression als das entsprechende Monomer. Durch die spezifische Integration von Plasmid-DNA ins Genom von Zielzellen mittels Streptomyces Bakteriophage phiC31 Integrase ist es möglich grundsätzlich in vitro, als auch in vivo stabile Transgenexpression zu erreichen. Um die Möglichkeit zu untersuchen, mittels phiC31 Integrase stabilen Gentransfer in hämatopoetischen Zellen zur erreichen, wurden verschiedene Vektoren zur Integration mit unterschiedlichen Integrase-kodierenden Plasmiden kotransfiziert. Diese führten allerdings, verglichen mit Kontrollexperimenten, nicht zu erhöhter oder verlängerter Transgenexpression. Ausschließlich mit relativ hohen Mengen an Integrase-kodierender mRNA konnte erhöhte Langzeit-Transgenexpression erzielt werden. Dies steht in Kontrast zu bisherigen Untersuchungen in Zellen anderer Gewebe. Um die Aktivität der Integrase in hämatopoetischen Zellen genauer zu untersuchen, wurde ein optimierter Versuchsaufbau entwickelt. Hierbei wurde die Integrase-vermittelte Rekombination episomaler Plasmid-DNA zwischen den Wildtyp-attB- und attP-Sequenzen in hämatopoetischen Zellen und Zellen anderer Gewebe untersucht. Dabei ergab sich sowohl bezüglich Integrase- vermittelter β-Galaktosidase-Expression als auch bei der Quantifizierung der Rekombinationsprodukte eine deutlich reduzierte Aktivität der Integrase in den untersuchten hämatopoetischen Zelltypen. Um die zellspezifischen Unterschiede in der Aktivität der Integrase im Detail zu untersuchen, wurde ein direkter Vergleich von Jurkat-T-Zellen und A549-Alveolar-TypII-Zellen durchgeführt. Hierbei wurden nach Transfektion unterschiedlicher Integrase-Konstrukte jeweils circa 16-fach höhere Integraseaktivität in Lungenzellen beobachtet. Aus der Literatur ist bekannt, dass die Interaktion der phiC31 Integrase mit zellulärem DAXX-Protein zur Inhibierung der Integraseaktivität führt. Um einen Zusammenhang der reduzierten relativen Aktivität der phiC31 Integrase in hämatopoetischen Zellen mit DAXX zu untersuchen, wurde zelluläres DAXX in Jurkat -, sowie in A549-Zellen auf Protein-Ebene detektiert. Die deutlich verringerte Aktivität der Integrase in hämatopoetischen Zellen, verglichen mit anderen Geweben, könnte auf eine höhere Expression von DAXX-Protein in hämatopoetischen Zellen zurückgeführt werden. Eine Alternative zur stabilen Integration von Plasmid-DNA ins Genom stellt die stabile Transfektion extrachromosomaler Plasmid-DNA dar. Es konnte gezeigt werden, dass durch die Einführung einer Scaffold Matrix Attachment Region zwischen Transgen und polyA-Schwanz im Plasmid episomale Replikation in hämatopoetischen Zellen vermittelt werden kann (Papapetrou et al., 2006). In den Untersuchungen musste allerdings nach Transfektion des Vektors pEPI1 ein mehrwöchiger Selektionsdruck mit G418 angewendet werden, um episomale Replikation und Langzeit-Expression zu erreichen. Um den Einfluss des Promotors in Kombination mit der huINF β-S/MAR zu untersuchen, und die Möglichkeit zu testen, durch den Austausch des Promotors stabile Transgenexpression ohne Selektionsdruck zu erreichen, wurden Konstrukte mit dem Ubiquitin B- oder dem Ubiquitin C-Promotor in Kombination mit der huINF β-S/MAR bezüglich Transgenexpression in vitro und in vivo charakterisiert. Sowohl unter Kontrolle des Ubiquitin B- als auch des Ubiquitin C Promotors konnte in Kombination mit der S/MAR in vitro eine erhöhte und verlängerte Transgenexpression in hämatopoetischen Zellen ohne die Anwendung von Selektionsdruck beobachtet werden. Die Untersuchungen des Status der transfizierten Plasmid-DNA zu verschiedenen Zeitpunkten nach Transfektion ergab jeweils das Vorhandensein extrachromosomaler S/MAR-enthaltenden Vektoren. In vivo konnte ebenfalls eine erhöhte Transgenexpression in Lunge und Leber der S/MAR-Konstrukte über einen Zeitraum von sechs Monaten beobachtet werden. Der in vivo Effekt der huINF β-S/MAR lag hier vor allem einer Verringerung des Gen-silencing. Zusammenfassend konnte durch die Verwendung von Plasmid-Konkatemeren die Transgenexpression deutlich gesteigert werden. Stabile Transgenexpression durch die spezifische Integration von Plasmid-DNA mittels phiC31 Integrase konnte in hämatopoetischen Zellen durch die Interaktion der Integrase mit dem zellulären Protein DAXX nicht erreicht werden. Dagegen konnte dies nach Transfektion von Plasmid-DNA mit geeigneten Promotoren und der huINF β-S/MAR durch den extrachromosomalen Verbleib der DNA und verlängerte Transgenexpression in der Zelle erreicht werden.

The overall aim of this thesis was the optimization of nonviral gene transfer particularly into hematopoietic cells. High transfection efficiencies and transgene expressions were achieved by the use of plasmid DNA (pDNA) concatemers. In further parts of the study it was investigated to which extend stable transgene expression could be achieved either with persistent extrachromosomal pDNA or with integrated pDNA into the genome of hematopoietic cells. The investigation of a pDNA dimer in comparison to its monomer resulted in significant differences regarding intracellular localization and transgene expression after transfection. When equimolar ratios of gene copies were transfected, no difference was found with respect to EGFP expression per transfected cell. Interestingly higher EGFP expression was found in dimer- transfected cells, when equimolar ratios of plasmid molecules were transfected. Further, the intracellular localization of the different constructs was investigated after transfection of equimolar ratios of either gene copies or pDNA molecules. From the relative amounts of pDNA present in the nucleus and the resulting transgene expression the relative transcription efficiency was calculated. Interestingly the dimeric pEGFP-N1 molecule mediated transgene expression with a 3.5-fold higher efficiency compared to its monomer. The bacteriophage Streptomyces phiC31 integrase is a promising tool to achieve safe and stable nonviral gene transfer, for the reason that it mediates site specific integration of pDNA into mammalian host genomes. To investigate the potential of the integrase to mediate stable gene transfer into hematopoietic cells, a variety of donor plasmids and integrase constructs were co-transfected. However this did not lead to enhanced long-term expression compared to control experiments. Only transfection of high amounts of integrase mRNA led to enhanced long-term expression. These data in hematopoietic cells are contrary to former findings in other tissues. An optimized assay was developed to further investigate the integrase activity in hematopoietic cells. Therefore, integrase-mediated recombination of episomal pDNA between wild-type attB and attP sites was determined in hematopoietic cells and cells of other tissues. Significantly reduced activity of the integrase in all investigated hematopoietic cells was observed by determination of integrase-mediated β-galactosidase activity and quantification of recombination products. To investigate this effect in further detail, additional experiments in A549 lung and Jurkat T cell lines were performed. Integrase-mediated transgene expression and recombination was determined in context with intranuclear integrase mRNA expression In independent experiments with different integrase construct, the phiC31 integrase efficacy was approximately 16-fold higher in A549 lung cells than in hematopoietic Jurkat cells. It has previously been published that the cellular protein DAXX interacts with the phiC31 integrase and inhibits its recombination efficiency. To investigate DAXX protein as a possible inhibitor of the integrase in hematopoietic cells, western blot analysis was performed. Higher levels of DAXX in hematopoietic cells might be one reason for this discrepancy. An alternative to integrating systems is the stable transfection of extrachromosomal pDNA. It has recently been published that episomal replication of pDNA can be achieved in hematopoietic cells by cloning a Scaffold Matrix Attachment Region (S/MAR) between transgene and polyA tail in the pDNA (Papapetrou et al., 2006). However, an initial selection with G418 for 2-3 weeks after transfection is necessary to mediate episomal replication and long-term transgene expression. To test the influence of the promoter in combination with the huINF β-S/MAR on the necessity of initial selection pressure, Ubiquitin C and Ubiquitin B promoter comprising constructs were transfected in vitro and in vivo. Both constructs mediated enhanced long-term transgene expression without application of G418-selection compared to the S /MAR-free plasmids. At different time points post transfection extrachromosomal S/MAR-comprising pDNA could be detected. Further, enhanced long-term expression of S/MAR comprising vectors for up to six months was found in lung and liver tissue in vivo. The in vivo effect of the S/MAR sequence rather seems to be a reduction of gene silencing. In conclusion, using a dimeric pDNA concatemer led to higher transgene expression per pDNA molecule compared to its monomer. phiC31 integrase mediated long-term transgene expression could not be achieved in hematopoietic cells presumably due to the interaction of the integrase with cellular DAXX protein. In contrast transfection of pDNA comprising Ubiquitin C or Ubiquitin B promoters and S/MAR led to enhanced transgene expression due to improved extrachromosomal persistence of these vectors.