dc.contributor.author
Tröster, Philip
dc.date.accessioned
2018-06-07T22:13:43Z
dc.date.available
2016-03-24T08:22:12.622Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/9009
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-13208
dc.description.abstract
Studies on afferent axon projections from sensory dorsal root ganglia (DRG)
neurons into the spinal cord have demonstrated that the growth cone splitting
(bifurcation) of these axons at the dorsal root entry zone into two daughter
branches, which elongate either in caudal or rostral direction, is controlled
by a Npr2-mediated cGMP signaling cascade. The aim of the thesis was twofold
with respect to this bifurcation-inducing cGMP signaling cascade: (1) the
generation of a floxed Npr2 mouse model for behavioral studies in order to
gain first in vivo insights into the physiological function of axon
bifurcation at the dorsal root entry zone, and (2) the investigation of
mechanisms that regulate Npr2 activity as well as the search for potential
protein interactions of components of the cGMP signaling cascade. (1) The
generation of a conditional Npr2 knockout mouse was necessary due to the fact
that Npr2-mediated cGMP signaling also contributes to the development and
function of other tissues such as bone by endochondral ossification and the
meiotic arrest of oocytes. Therefore, the loss of Npr2 function had to be
confined to DRG neurons in order to allow interpretable behavioral studies and
to clarify whether the transmission of sensory stimuli by afferent axons is
hampered by impaired axonal branching in the spinal cord. The Cre-loxP
recombination system was used as a genetic tool and a transgenic mouse model
was generated containing two loxP target sites flanking exon 17 and exon 18 of
the Npr2 gene. Whereas a first attempt to generate a floxed Npr2 mouse
resulted in a hypomorphic phenotype due to a splice site mutation, the second
attempt succeeded with the creation of the intended conditional Npr2 mouse
mutant. Using the Wnt1-Cre mouse as a driver for Cre expression, experimental
animals were generated which displayed undisturbed bone development in
combination with impaired axon bifurcation. First behavioral studies
(Hargreaves test) have revealed that the acute pain perception is reduced in
these animals due to the lack of axon bifurcation. In general, the floxed Npr2
mouse provides a valuable tool for the investigation of Npr2-related
phenotypes and therefore should be instrumental in studies of bone
development, oogenesis or other Npr2-mediated physiological processes. (2) In
order to analyze the regulation of Npr2 activity, site-directed mutagenesis of
Npr2 followed by subsequent determination of the receptor activity revealed
that cGMP production by the guanylyl cyclase domain of the receptor depends on
the phosphorylation of five phosphorylation sites (Ser-513, Thr-516, Ser-518,
Ser-523 and Ser-526) within the kinase homology domain of Npr2. Furthermore,
to ascertain whether the cGMP signaling pathway is engaged in cross-talk with
other proteins or signaling pathways, the proximity-dependent biotin
identification (BioID) labeling assay based on the promiscuous biotin ligase
BirA* was applied to screen for potential interaction partners of Npr2 and
cGKIα in cell lines. Thus, a number of Npr2-specifically and cGKIα-
specifically purified proteins were identified by mass spectrometry. The in
vitro data of the biotin labeling assay provided first information about new
potential interactors of the cGMP signaling cascade. However, it remains for
future studies to experimentally confirm the actual link to cGMP signaling and
the participation in axon bifurcation.
de
dc.description.abstract
Untersuchungen an Axonen von Spinalganglienneuronen im Rückenmark haben
gezeigt, dass deren axonale Gabelung (Bifurkation), die beim Einwachsen in das
Rückenmark entsteht, von einer Npr2-abhängigen cGMP-Signaltransduktion
kontrolliert wird. Dabei entstehen zwei Tochteraxone, die konträr zueinander
in rostraler und kaudaler Richtung entlang der Rückenmarksegmente
weiterwachsen. Fehlt ein Mitglied der cGMP-Signalkaskade, wächst das Hauptaxon
ohne zu bifukieren in nur einer Richtung im Rückenmark weiter. Die Zielsetzung
der Doktorarbeit umfasste zwei Schwerpunkte hinsichtlich dieser axonalen
Verzweigung im Rückenmark: (1) die Herstellung einer gefloxten Npr2
Mausmutante für verhaltensbiologische Untersuchungen, um erste In-vivo-
Erkenntnisse über die physiologische Funktion der axonalen Verzweigung zu
gewinnen und (2) die Untersuchung von Regulationsmechanismen, die die
Aktivität von Npr2 kontrollieren sowie die Suche nach weiteren Proteinen, die
mit der cGMP-Signalkaskade interagieren und eine Rolle für die axonale
Verzweigung spielen. (1) Die Erzeugung einer konditionellen Npr2-Mausmutante,
bei der das Npr2 Gen nur in den sensorischen Neuronen deaktiviert wird, war
notwendig, da auch das Längenwachstum von Knochen (enchondrale Ossifikation)
und der meiotische Arrest von Oozyten durch Npr2-vermittelte cGMP-
Signaltransduktion reguliert wird. Eine gefloxte Npr2 Mausmutante wurde
erzeugt, bei der zwei loxP-Sequenzen das Exon 17 und Exon 18 des Npr2 Gens
flankieren. Die erste erzeugte gefloxte Npr2-Mausmutante wies allerdings auf
Grund von Punktmutationen im Bereich der Exon-Intron-Grenzen bereits einen
hypomorphen Phänotyp auf. Erst mit einer mutationsfreien, gefloxten Npr2-Maus
und mittels der Wnt1-Cre-Maus konnte eine konditionelle Npr2-defiziente
Mausmutante mit normaler Knochenentwicklung, aber ohne Bifurkation der
sensorischen Axone im Rückenmark, erzeugt werden. Erste verhaltensbiologische
Untersuchungen (Hargreaves Test) haben gezeigt, dass die akute
Schmerzwahrnehmung von Tieren mit axonaler Bifurkationsstörung im Rückenmark
reduziert ist. Die erzeugte gefloxte Npr2-Mausmutante ist darüber hinaus ein
geeignetes Mausmodell, mit dessen Hilfe die Funktion der Npr2-vermittelten
cGMP-Signaltransduktion auch in anderen Npr2-abhängigen physiologischen
Prozessen untersucht werden kann. (2) Die In-vitro-Aktivität von
Npr2-Mutanten, die durch ortsgerichtete Mutagenese verändert wurden, hat
gezeigt, dass die Phosphorylierung des Rezeptormoleküls für die enzymatische
Aktivität von großer Bedeutung ist. Nur wenn fünf Phosphorylierungsstellen
(Ser-513, Thr-516, Ser-518, Ser-523 und Ser-526) innerhalb der Kinase-
Homologie-Domäne von Npr2 phosphoryliert sind, kann der Ligand CNP die
Guanylatzyklase-Aktivität des Rezeptors und somit die cGMP-Produktion
vollständig induzieren. Um mögliche Interaktionspartner der cGMP-Signalkaskade
nachzuweisen, die an der Rezeptorregulation oder der Strukturveränderung des
Zytoskeletts beteiligt sind, wurde eine Biotin-Markierungs-Analyse (BioID)
basierend auf der promisken Biotin-Protein-Ligase BirA* etabliert. Mit Hilfe
von BirA*-Hybridproteinen von Npr2 und cGKIα, Streptavidin-Aufreinigung und
massenspektrometrischer Analyse wurden Proteine bestimmt, die spezifisch für
Npr2 oder cGKIα nachgewiesen werden konnten und somit potentielle
Interaktionspartner der cGMP-Signalkaskade sind.
de
dc.format.extent
177 Seiten
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
sensory axon bifurcation
dc.subject
cGMP signaling cascade
dc.subject
floxed Npr2 mouse model
dc.subject
sensory perception
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie::570 Biowissenschaften; Biologie
dc.title
Physiological role of sensory axon bifurcation in DRG neurons mediated by
Npr2-dependent cGMP signaling
dc.contributor.contact
philip.troester@mdc-berlin.de
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. Fritz G. Rathjen
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Carmen Birchmeier-Kohler
dc.date.accepted
2015-06-29
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000101524-0
dc.title.translated
Die physiologische Rolle der axonalen Bifurkation von sensorischen DRG-
Neuronen vermittelt durch Npr2-abhängige cGMP-Signaltransduktion
de
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000101524
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000018885
dcterms.accessRights.dnb
free
dcterms.accessRights.openaire
open access