Validierung eines Urinproteom-Klassifikators zur Frühdiagnose der diabetischen Nephropathie

Abstract

Nach Zahlen der International Diabetes Federation (IDF) von 2013 leiden derzeit 8,1 % der erwachsenen Bevölkerung in der Europäischen Union am Diabetes mellitus. Eine der wesentlichsten Spätkomplikationen des Diabetes ist die diabetische Nephropathie. Sie ist eine der Hauptursachen einer Niereninsuffizienz. Eine zuverlässige Frühdiagnos-tik der diabetischen Nephropathie ist daher höchst notwendig. Jüngst wurden 273 spe-zifische Peptide im Urin identifiziert, aufgrund derer ein diagnostischer Klassifikator ge-nannt „CKD273“ (CKD: engl. für chronische Nierenerkrankungen) entwickelt werden konnte, der in der Lage ist, diabetische Nephropathie frühzeitig zu erkennen. Da sich diese Diagnostik auf Urinproteomprofile stützt, ist sie nicht-invasiv und theoretisch so-wohl im klinischen als auch wissenschaftlichen Umfeld einsetzbar. Um den „CKD273“-Klassifikator diagnostisch einsetzen zu können, bedarf es jedoch noch einer umfassen-den Validierung. Daher wurden im Rahmen der hier vorliegenden Dissertation Untersu-chungen zur Validierung und Optimierung des betreffenden „CKD273“-Klassifikators durchgeführt. Im ersten Abschnitt dieser Arbeit wurde der „CKD273“-Klassifikator in einer multizentri-schen Kohorte getestet. Diese Validierung des „CKD273“-Klassifikators zeigte eine ho-he statistische Genauigkeit (AUC=0,95). Zusätzlich wurde die Zuverlässigkeit des „CKD273“-Klassifikators in Abhängigkeit von der Lagerung der Proben, sowie Alter und Geschlecht der Patienten untersucht. Hierbei zeigte sich, dass das Diagnoseergebnis unabhängig von diesen Parametern ist. Im zweiten Abschnitt wurde das Urinproteom eines gängigen Tiermodells für Diabetes-Typ-II- assoziierte Komplikationen, das so genannte „Zucker diabetic fatty“ (ZDF) Rat- tenmodell, mittels Kapillarelektrophorese-gekoppelter Massenspektrometrie analysiert. Im Vergleich zu gesunden Ratten wurden 180 für das ZDF- Rattenmodell spezifische Peptide definiert und mit den humanen Peptidbiomarkern aus dem „CKD273“-Klassifikator, sowie mit Peptidbiomarkern für kardiovaskuläre Erkrankungen verglichen. Das ZDF-Rattenmodell wies in dieser vergleichenden Studie eine bessere Überein-stimmung mit den Peptidbiomarkern für kardiovaskuläre Schäden als mit den Peptid-biomarkern für chronische Nierenerkrankungen auf. Dies bestätigte sich bei der Analyse der mit den Peptidsequenzen assoziierten Proteaseaktivitäten. Im dritten Teil dieser Dissertation wurden zur Reduzierung des Analysenaufwands bei der Diagnostik mit dem CKD273-Klassifikator Versuche durchgeführt, die betreffenden Analysen auf eine weitere massenspektrometrische Technologieplattform zu übertragen. Als kostengünstigere und zeitsparende Diagnostik wurde dazu die Matrix-unterstützte Laser-Desorption/Ionisation- Massenspektrometrie (MALDI-Massenspektrometrie) gewählt. Die Diagnose der diabetischen Nephropathie mittels MALDI-Massenspektrometrie resultierte in einer geringeren statistischen Genauigkeit (AUC=0,83) verglichen mit der Kapillarelektrophorese-gekoppelten Massenspektro-metrie (AUC=0,95), wies jedoch Potential zur Vorauswahl der Patienten auf. Die vorliegende Dissertationsschrift bestätigt insgesamt die Validität und diagnostische Stabilität des „CKD273“-Klassifikators. Sie zeigt weitere Möglichkeiten zur weniger zeit-aufwendigen und kostengünstigeren Diagnostik mittels MALDI- Massenspektrometrie auf. Des Weiteren wird das Potential der verwendeten Biomarker zur Beurteilung von Tiermodellen aufgezeigt, wobei die Ergebnisse jedoch darauf hinweisen, dass das ZDF-Rattenmodell eher zur Untersuchung von makrovaskulären Schäden geeignet ist.

According to results published by the International Diabetes Federation (IDF) in 2013, 8.1 % of the adult population in the European Union had diabetes mellitus. Diabetic nephropathy is one of the most critical complications of diabetes mellitus occurring at later stages and leading to renal failure. Thus, reliable and early diagnosis of diabetic nephropathy is highly desirable. Recently, 273 specific discriminatory peptides were identified in urine, which were used to establish the „CKD273“-classifier (CKD: chronic kidney disease) to early detect diabetic nephropathy. This non-invasive diagnostic tool is based on urine proteome profiles and is useful for research and clinical approaches. However, before this classifier could be considered for routine clinical diagnostics, ex-tensive and comprehensive validation is necessary. Therefore, the analyses for valida-tion and improvement of „CKD273“-classifier were performed within this thesis. The „CKD273“-classifier was utilized in a multicenter study and it demonstrated a high accuracy (AUC=0.95) in the validation cohort. In addition, the dependence of the classi-fier on patients’ age and sex as well as on storage conditions of the urine samples was investigated and showed independency of these parameters. The urinary proteome of a commonly used animal model for diabetes-type-II- associated complications, the "sugar diabetic fatty" (ZDF) rat model, was analyzed by capillary-electrophoresis coupled to mass-spectrometry. In comparison to control rats, 180 spe-cific peptides for ZDF rats were identified. When further compared to the previously de-fined „CKD273“-classifier and human peptide biomarkers for cardiovascular diseases, the ZDF-specific peptides showed a better overlap with the biomarkers for cardiovascu-lar damage rather than the ones for CKD. This result was confirmed in the analysis of the protease activities associated with identified peptides. The third part of this thesis focused on the reduction of the analysis effort for diagnosis using the „CKD273“-classifier. An attempt was then made to transfer the model to an-other mass-spectrometry technology platform in order to optimize the diagnosis in terms of time and cost. For this matter, matrix-assisted laser desorption/ionization mass-spectrometry (MALDI mass-spectrometry) was used. However, the diagnosis of diabetic nephropathy by the MALDI mass-spectrometric approach resulted in lower accuracy (AUC=0.83) in comparison to capillary electrophoresis-coupled mass- spectrometry (AUC=0.95), but showed potential in the pre-selection of patients. Results of the thesis confirm the validity and stability of the „CKD273“-classifier, high-lighted the ability to transfer results in another mass-spectrometry platform in a less te-dious and more cost-effective manner, and the potential of the biomarkers for the evaluation of animal models. In addition, the results show that the ZDF rat model is suitable for the investigation of macrovascular damages.