Untersuchungen zum Vorkommen von Helcococcus ovis bei der Endokarditis des Rindes sowie zur phänotypischen Charakterisierung und Empfindlichkeitsprüfung der Isolate

Abstract

Im Zeitraum September 2006 bis Februar 2008 wurden 55 Rinderherzen mit pathomorphologischen Veränderungen i. S. einer Endocarditis valvularis thromboticans bakteriologisch untersucht. Die Anzucht erfolgte als Ammenkultur unter Verwendung von Columbia-Blutagar und einem S. aureus-Stamm. Es wurden 18 verdächtige Isolate gewonnen, i. d. R. als hochgradiges Wachstum und in Reinkultur. Mittels Sequenzanalyse eines ca. 1300 bp langen Abschnittes des 16S rRNA-Gens konnten alle Isolate als H. ovis bestätigt werden. Die H. ovis- Isolate stellten sich als Katalase-negative, fakultativ anaerobe, Vancomycin- sensible, in Paaren und Haufen gelagerte Gram-positive Kokken dar. Als phänotypisches Hauptcharakteristikum zeigte die überwiegende Mehrheit der Isolate Satellitismus in der S. aureus-Peripherie bzw. Pyridoxal-Abhängigkeit. H. ovis gleicht darin den sog. „nutritionally variant streptococci“ die aktuell den Genera Abiotrophia und Granulicatella zugeordnet sind. Biochemische Leistungen wurden mittels der Systeme API rapid ID 32 Strep, API ZYM und Rosco Diatabs geprüft und hierbei z. T. divergente Resultate erzielt. Gestützt auf die Merkmale Satellitismus/Pyridoxal-Abhängigkeit und Hämolyse auf Blutagar sowie acht API rapid ID 32 Strep basierte bioche¬mische Tests wurde ein Schema für die Identifizierung von H. ovis und dessen Differenzierung von anderen Helcococcus spp. sowie den Pyridoxal-abhängigen Spezies A. defectiva, G. adiacens und G. elegans entwickelt. Die Empfindlichkeitsprüfung der H. ovis-Isolate erfolgte für 22 Wirkstoffe aus 11 Substanz-klassen im Bouillon-Mikrodilutionsverfahren entsprechend einer anerkannten CLSI-Richtlinie für A. defectiva und Granulicatella spp.. Trotz des relativ kleinen Testkollektivs wurden zahlreiche Resistenzen festgestellt. So waren vier Isolate (22,2 %) resistent gegen Enrofloxacin, 15 Isolate (83,3 %) resis¬tent gegen Tetracyclin und 12 Isolate (66,0 %) resistent gegen potenzierte Sulfonamide. Darüber hinaus konnten für zwei Isolate (11,1 %) Makrolid-Lincosamid-Streptogramin B (MLSB)-Resistenzen, sowohl konstitutiv als auch induzierbar, nachgewiesen werden. Basis für die Entwicklung eines selektiven bzw. elektiven Mediums zum Nachweis von H. ovis war eine Modifikation des in der Mastitisdiagnostik gebräuchlichen Edwards-Nährbodens. Um für H. ovis geeignete Wachstumsbedingungen zu schaffen, wurde dieses Medium um Pyridoxal-HCl ergänzt und zum Zwecke der verbesserten Hemmwirkung auf Gram- negative Keime Aztreonam hinzugefügt. Die Evaluierung des Helcococcus- Elektivagars (HEA) erfolgte mittels „ecometric technique“ nach MOSSEL und unter Einbeziehung aller H. ovis-Isolate sowie von 35 Kontrollstämmen verschiedener Gram-positiver und Gram-negativer Bakterienspezies. Im Er¬gebnis konnte eine sehr gute Produktivität und Selektivität für Katalase-negative, Gram-positive Kokken, einschließlich Helcococcus spp., festgestellt werden. Die Differenzierung der Helcococcus spp. von anderen Katalase-negativen, Gram- positiven Kokken gelang nach 72 h Bebrütung bei 36 ± 1 °C und erhöhter CO2-Spannung relativ einfach anhand der Charakteristika Koloniedurchmesser < 1 mm, fehlende Hämolyse sowie fehlende Schwärzung. Eine Diskriminierung innerhalb der Gattung Helcococcus war dagegen nicht möglich.

Between September 2006 and February 2008, specimens from 55 bovine hearts with valvular endocarditis were examined by culture using Columbia blood agar and cross streaking the inoculated plate with a Staphylococcus aureus strain. H. ovis was isolated from 18 cases, mainly as heavy growth and pure culture. Species identification was confirmed by sequence analysis of an approximately 1300 bp fragment of the 16S rRNA gene. All H. ovis isolates were gram positive, with cocci arranged in pairs and clusters. They were catalase negative, vancomycin sensitive and grew facultatively anaerobically. As a main feature, the vast majority of the H. ovis strains demonstrated distinct satellitism around the S. aureus streak and pyridoxal dependency, resembling the case for the so-called “nutritionally variant streptococci”, which are now assigned to the genera Abiotrophia and Granulicatella. Using the API rapid ID 32 Strep, API ZYM, and Rosco Diatabs systems, incongruent results were obtained for some biochemical reactions. Based on the characteristics satellitism/pyridoxal dependency, hemolysis on blood agar, and eight biochemical reactions included in the API rapid ID 32 Strep, a scheme for the identification of H. ovis and its differentiation from other Helcococcus spp. and the pyridoxal-dependent species Abiotrophia defectiva, Granulicatella adiacens, and Granulicatella elegans was proposed. Susceptibility testing of the H. ovis isolates was carried out for 22 agents from 11 antibiotic classes using broth microdilution method according to an approved CLSI guideline for A. defectiva and Granulicatella spp.. Despite the small number of test subjects, numerous resis-tances to agents from different antibiotic classes were observed. Four isolates (22.2%) were resistant to enrofloxacin, 15 (83.3%) to tetracycline and 12 (66.0%) to trimethoprim/sulfamethoxazole. Furthermore, two isolates (11.1%) displayed coresistence, both constitutively and inducibly, to macrolide, lincosamide and streptogramine B (MLSB) antibiotics. The development of a selective or elelective medium, respectively, based on the modified Edwards medium commonly used in mastitis diagnostics. To ensure appropriate conditions for the growth of H. ovis, this medium was supplemented with pyridoxal HCl. Moreover, aztreonam was added to enhance the inhibition of gram-negative bacteria. Evaluation of the Helcococcus elective agar (HEA) was carried out by application of the “ecometric technique” proposed by MOSSEL. Using this method, all H. ovis isolates and 35 control strains of various gram-positive and gram-negative bacteria were tested for growth, resulting in a very good productivity and selectivity for the catalase-negative gram-positive cocci including Helcococcus spp.. After incubation for 72 h at 36 ± 1°C in an atmosphere of 6% CO2, the discrimination of Helcococcus spp. from other catalase-negative gram- positive cocci was relatively simple considering the characteristics colony diameter < 1 mm and absence of both hemolysis and blackening. In contrast, differentiation within the Helcococcus genus was not possible.