Das Ziel dieser Arbeit war die Synthese hormonell aktiver und fluoreszierender 2,2'-Bisbenzimidazole (BBIs) zwecks Untersuchungen zur Visualisierung des Estrogenrezeptors (ER) in humanen Tumorzellen. Aufbauend auf den im Arbeitskreis um Prof. Gust vorliegenden Erkenntnissen zur Darstellung inhärent fluoreszierender ER-Liganden wurden Synthesen und spektroskopische sowie pharmakologische Untersuchungen von BBIs durchgeführt. Die Strukturmodifikationen erfolgten durch N-Alkylierung oder N-Arylierung, durch N,N'-Verbrückung oder Variationen der 2,2'-Überbrückung der beiden Benzimidazolringe. Aufgrund der Stellung der beiden phenolischen Hydroxygruppen ergaben sich Konstitutionsisomere, die entweder direkt synthetisiert oder durch Auftrennung von Isomerengemischen isoliert werden konnten. Als Voraussetzung für in vitro Untersuchungen sollten die synthetisierten BBIs gute Fluoreszenzeigenschaften wie hohe Fluoreszenzintensitäten und Emissionsmaxima > 400 nm zeigen, um sich in Zellaufnahmen vom Hintergund der Zellen abzuheben. Die Stellung der beiden phenolischen Hydroxygruppen spielt eine wesentliche Rolle: So konnte dargelegt werden, dass die BBIs mit Hydroxygruppen in 6,6'-Stellung (z. B. 1,1'-Diethyl-[2,2'-bi-1Hbenzimidazol]-6,6'-diol 61: 10-4 M in PBS: lEm = 398 nm, Irel = 1732) im Vergleich zu den BBIs mit Hydroxygruppen in 5,5'-Stellung (z. B. 1,1'-Diethyl-[2,2'-bi-1H-benzimidazol]-5,5'-diol 56: 10-4 M in PBS: lEm = 424 nm, Irel = 129) über höhere Fluoreszenzintensitäten verfügen, aber Bandenverschiebungen der Emissionsmaxima zu kleineren Wellenlängen aufweisen. Des Weiteren sollten die Verbindungen keine wachstumshemmenden Eigenschaften haben, damit ihre hormonellen Effekte in zellbasierten Assays untersucht werden können. Im Kristallviolettassay wurde in Konzentrationen bis 20 μM für die Verbindungen 54-77 und 80-83 keine nennenswerte Wachstumshemmung an der MCF-7-, MDA-MB-231- und U2OSZelllinie gefunden. Im kompetitiven Bindungsassay wiesen die Verbindungen (54-83) keine ausreichende Bindung an ERa/b auf. In Transaktivierungsassays hingegen zeigte sich teilweise eine signifikante estrogene Wirkung, die auf Interaktionen mit dem ERa schließen lässt (z. B. 1,1'-Diethyl-[2,2'-bi-1H-benzimidazol]-5,5'/5,6'/6,6'-diol 66: EC50 = 2,7×10-7 M, relative Aktivierung = 100±3 %). Dass generell eine Interaktion der BBIs mit dem ERa möglich ist, konnte in Molecular-Modelling-Untersuchungen gezeigt werden. Mittels Epifluoreszenzmikroskopie konnte für ausgewählte Verbindungen (61 und 75) lediglich eine Lokalisation im Zytoplasma der Zellen ausgemacht werden. Für die Ermittlung der Konzentration und Verteilung des ER in Brustkarzinomzellen bei der klinischen Diagnose sind die Substanzen demnach nicht geeignet. Ein interessanter Ansatz für die Weiterentwicklung der Substanzen ist deren Einfluss auf den zellulären ERa-Gehalt. Sie sind in der Lage, diesen deutlich zu verringern (Verbindungen 55-57 und 60-62 wurden getestet). Ferner zeigen die Verbindungen mit einer Methoxygruppe in o-Stellung zur phenolischen Hydroxygruppe eine wachstumshemmende Wirkung an den hormonabhängigen MCF-7-Zellen (Verbindung 78: IC50 = 6,2 μM, Verbindung 79: IC50 = 8,1 μM). Dieser antiproliferative Effekt kann ebenfalls ein interessanter Ansatz für weitere Untersuchungen dieser Substanzen sein.
The aim of this work was the synthesis of hormonally active and fluorescent 2,2'-bisbenzimidazoles (BBIs) for visualisation of the estrogen receptor (ER) in human tumor cells. Based on former results of Prof. Gust's working group about the synthesis of inherently fluorescent ER-ligands BBIs were synthesised and pharmacologically as well as spectroscopically analysed. Structural modifications included N-alkylation or N-arylation, N,N'-bridging or varying the 2,2'-bridging of the two benzimidazole rings. Constitutional isomers resulting because of the position of the two hydroxyl groups were either directly synthesised or isolated from mixtures. As prerequisite for in vitro testing, the synthesised BBIs should have good fluorescence properties e. g. high fluorescence intensities and emission maxima > 400 nm in order to be visualised during cell recording. For these purpose the position of the two phenolic hydroxyl groups plays an important role: it could be demonstrated that the BBIs with hydroxyl groups in 6,6'-position (e. g. 1,1'-diethyl-[2,2 '-bi-1H-benzimidazole]-6,6'-diole 61: 10-4 M in PBS: lEm = 398 nm, Irel = 1732) compared to BBIs with hydroxyl groups in 5,5'-position (e. g. 1,1'-diethyl-[2,2'-bi-1H-benzimidazole]-5,5'-diole 56: 10-4 M in PBS: lEm = 424 nm, Irel = 129) witness higher fluorescence intensities but exhibit band shifts of emission maxima to shorter wavelengths. Furthermore the growth- inhibiting properties of the compounds should be low, so that their hormonal effects can be studied in cell-based assays. Concentrations up to 20 μM were tested in the crystal-violet assay on MCF-7-, MDA-MB-231- und U2OS-cell-line but no significant growth inhibition were detected for compounds 54-77 and 80-83. In the competitive binding assay the compounds (54-83) exhibit no sufficient affinity to ERa/b. However, in transactivation assays they showed significant estrogenic effects that suggest possible interactions with ERa (e. g. 1,1'-diethyl-[2,2'-bi-1H-benzimidazole]-5,5'/5,6'/6,6'-diole 66: EC50 = 2,7×10-7 M, relative activation = 100±3 %). The possibility of the BBIs to bind to ERa was further confirmed in molecular-modelling-studies. Epifluorescence microscopy showed for selected compounds (61 and 75) only a localisation in the cytoplasm. Therefore the investigated substances are not suitable to determine in an active way the concentration and distribution of ER in breast carcinoma cells for clinical diagnostics. An interesting aspect for further investigations is the property of some of the synthesised BBIs to down-regulate ERa (compounds 55-57 and 60-62 have been tested). Furthermore, the compounds with a methoxy group in o-position to the phenolic hydroxyl group showed a growth inhibiting effect on the hormone-dependent MCF-7-cells (compound 78: IC50 = 6,2 μM, compound 79: IC50 = 8,1 μM). This antiproliferative effect may also be of great interest for further investigations.
