Convergent Syntheses of Multivalent Binding Glycoconjugates

Abstract

The binding events of glycoproteins are often mediated by lectins and typically occur in cooperative or multivalent fashion. In this thesis, different strategies have been applied to study this multivalent binding events. 1) Rational design of multivalent binding neoglycoproteins: For initial proof-of-priniciple studies, a variant of E. coli barnase inhibitor protein (ψ-b*) containing four alkyne moieties was provided by combining site- directed mutagenesis and selective pressure incorporation (SPI). Subsequently copper-catalyzed alkyne-azide cycloaddition (CuAAC) with different carbohydrate azides were applied to furnish mono- and multivalent neoglycoproteins. A competitive lectin-binding surface plasmon resonance (SPR) assay with peanut agglutinin (PNA) pointed towards an increased binding due to the multivalent architecture. Following this success, a green fluorescent protein (GFP) with a defined spatial presentation of carbohydrates for binding to asialoglycoprotein receptor (ASGPR) was envisioned. Three different mutants were modified with six different carbohydrate azides by CuAAC. A series of flow cytometry experiments were performed with ASGP-R expressing cells and functional neoglyco-GFPs. Results of those experiments pointed towards a positive contribution for binding efficacy when ligands are presented in a certain spatial orientation. Those findings support the concept of rationally designed neoglycoproteins as structurally defined scaffolds for the elucidation of multivalent binding events. 2) Syntheses of sialic acid derivatives for bioconjugations: N-Acetyl neuraminic acid (Neu5Ac) is an important carbohydrate and often terminates mammalian glycans. Due to its biological relevance, glycoconjugates of Neu5Ac are desirable. In the context of generating multivalent binding neoglycoproteins, the chemical synthesis of Neu5Ac azide-derivatives was explored. Different sialyl-donors were prepared and tested for their applicability in generating Neu5Ac conjugates α-selectively. Finally the best outcome with very good α-selectivity and high yields of the glycosylation reaction was achieved by applying a thioadamantane donor. 3) Surface plasmon resonance of carbohydrate-polymer conjugates: Staudinger phosphite (SPtR) and Staudinger phosphonite reactions (SPnR) were used for the functionalization of azide-bearing polyglycerols. The so generated neoglycopolymers were subsequently evaluated for their suitability for chemical biology by different SPR assays. Polymers that were functionalized by SPtR achieved a strong inhibition of approximately 60% within a competitive lectin binding assay against PNA. For polymers modified by SPnR, strong binding to surface-bound PNA was observed, whereas azido- polyglycerol and polyacrylamide-conjugated Thomsen-Friedenreich antigen only showed weaker interaction. From the outcome of the SPR experiments it can be concluded that both SPtR and SPnR are sufficient copperfree conjugation strategies.

Die Bindungsereignisse von Glykoproteinen werden oft durch Lektine vermittelt und sind typischerweise kooperativ oder multivalent. In dieser Doktorarbeit wurden unterschiedliche Strategien angewandt um diese multivalenten Bindungsereignisse zu untersuchen. 1) Rationales Design multivalent-bindender Neoglyko­proteine: Als initialer Machbarkeitsnachweis wurde eine Variante des Barnase-Inhibitor-Proteins (ψ-b*) von E. coli mit vier Alkinen ausgestattet. Dies wurde durch eine Kombination von orts­spezifischen Mutationen und auxotrophem Einbau von unnatürlichen Aminosäuren verwirklicht. Anschließend wurden unterschiedliche Zuckerazide mittels Kupfer-katalysierter Alkin-Azid Cycloaddition (CuAAC) konjugiert und somit verschiedene mono- und multivalente Neoglykoproteine hergestellt. Eine kompetitive Lektin-Bindungsstudie mittels Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) mit Erdnuss-Agglutinin (PNA) deutete schließlich auf erhöhte Bindung aufgrund der multivalenten Architektur hin. Nach diesem Erfolg wurde ein grün-fluoreszierendes Protein (GFP) mit einer definierten räumlichen Ausrichtung an Zuckern für die Bindung an Asialoglykoprotein Rezeptor (ASGPR) entwickelt. Drei verschiedene Mutanten wurden mit sechs verschiedenen Zuckeraziden durch CuAAC modifiziert. Eine Reihe von Durchflusszytometrie-Experimenten mit ASGP‑R-exprimierenden Zellen und funktionalen Neoglyko-GFPs wurde durchgeführt. Die erhaltenen Resultate deuteten auf einen positiven Einfluss auf die effektive Bindung hin, sofern die Liganden eine bestimmte räumliche Orientierung aufweisen. Diese Beobachtungen unterstützen das Konzept von rational entworfenen Neoglykoproteinen als strukturell-definierte Plattformen für die Aufklärung multivalenter Bindungsereignisse. 2) Synthese von Sialinsäure-Aziden für Biokonjugationen: N-Acetyneuraminsäure (Neu5Ac) ist ein bedeutender Zucker, der oft am Ende von Säugetier-Glykanen zu finden ist. Aufgrund ihrer biologischen Relevanz sind Glykokonjugate von Neu5Ac wünschenswert. In diesem Zusammenhang wurde die chemische Synthese von Neu5Ac-Aziden für die Herstellung von multivalent-bindenden Glykoproteinen untersucht. Diverse Sialyl-Donoren wurden dargestellt und in Bezug auf ihre α-Selektivität untersucht. Schlussendlich wurden die besten Ergebnisse mit sehr guter α-Selektivität und hohen Ausbeuten bei Glykosylierungen mit Thioadamantan- Donoren erzielt. 3) Oberflächenplasmonenresonanz von Zucker-Polymer- Konjugaten: Die Staudinger-Phosphit-Reaktion (SPtR) und die Staudinger- Phosphonit-Reaktion (SPnR) wurden genutzt um Polyglycerolazide zu funktionalisieren. Die dadurch hergestellten Neoglykopolymere wurden anschließend auf ihre Einsetzbarkeit in der chemischen Biologie durch unterschiedliche SPR Assays evaluiert. Mittels SPtR funktionalisierte Polymere erzielten eine starke Inhibition von circa 60% bei einem kompetitiven Lektin Bindungs-Assay gegen PNA. Bei durch SPnR modifizierten Polymeren wurdeeine starke Bindung an oberflächengebundenem PNA beobachtet, wo hingegen Azido- Polyglycerol und Polyacrylamid-konjugiertem Thomsen-Friedenreich-Antigen schwächere Interaktion zeigten. Vom Ausgang der SPR-Experimente kann geschlussfolgert werden, dass SPtR und SPnR geeignete kupferfreie Konjugationsstrategien darstellen.