Die lichtinduzierte Antwort des Photorezeptors in Arabidopsis thaliana Cryptochrom-1

Abstract

Cryptochrome sind blaulichtsensitive Photorezeptoren, welche eine hohe sequenzielle und strukturelle Ähnlichkeit zur Proteinklasse der DNA-Schäden reparierenden Photolyasen, sowie den selben Flavin-Kofaktor aufweisen. Vertreter dieser Gruppe konnten in vielen Organismen, beginnend bei Pflanzen, über Tiere, bis hin zum Menschen, nachgewiesen werden, wobei Cryptochrome üblicherweise jedoch keine DNA-Reparaturfunktion besitzen. Die Bedeutung sowie der Wirkmechanismus dieser Proteine ist noch zu großen Teilen unverstanden, allerdings ist bekannt, daß der unter Dunkelbedingungen als voll oxidiertes Flavin vorliegende Kofaktor durch die Beleuchtung mir blauem Licht in seine Radikalform überführt werden kann. Da Elektronenspinresonanzexperimente ausschließlich paramagnetische Zentren detektieren, ist es mit Hilfe dieser Methode möglich, den semireduzierten Zustand des Flavins spezifisch zu untersuchen. In der vorliegenden Arbeit wurde Arabidopsis thaliana Cryptochrom-1 (AtCry-1) als typischer Vertreter aus der Unterklasse der pflanzlichen Cryptochrome betrachtet. Die dabei durchgeführten Experimente beleuchten die Fragestellungen bezüglich des Mechanismus' von AtCry-1 aus zwei unterschiedlichen Blickwinkeln. Zuerst wurde die Kinetik der Photoaktivierung und Dunkeladaption des Proteins in intakten Wirtszellen analysiert und der Einfluß von blauem und grünem Licht auf das erzeugte Flavinradikal beobachtet. Diese Messungen liefern wichtige physiologische Informationen, welche durch Versuche an aufgereinigtem Protein nicht ermittelt werden können. Vergleiche der Ganzzellexperimente mit Messungen an reinem Protein weisen zudem auf kleine strukturelle Unterschiede in der Orientierung des Kofaktors hin. Weiterhin konnten Messungen zum Elektronentransfer in direkter Folge der Aktivierung des Flavins durchgeführt werden. Die dabei gewonnenen Erkenntnisse weisen klare Unterschiede zu Beobachtungen an strukturell sehr ähnlichen Vertretern aus der Gruppe der Cry-DASH-Proteine und Photolyasen auf. Hier wird eindrucksvoll deutlich, daß bereits geringe Variationen in der Sequenz eines Proteins zu einem signifikant veränderten Verhalten führen können.

Cryptochromes are blue-light sensing photoreceptors found in plants, animals and humans, that share a high degree of structural and sequence homology with photolyases, and contain the same flavine cofactor. Yet, in contrast to photolyases, cryptochromes usually do not show a DNA-repair function and their mechanism of action is basically unknown. However, it could be shown, that blue light irradiation leads to an accumulation of the semi-reduced flavin radical state, while the fully oxidized flavin was found to be the dark stable ground state. For measuring the cryptochrome activation, electron paramagnetic resonance (EPR) provides a powerful tool. Since EPR-experiments are sensitive to radicals only, the semi-reduced flavin state can be probed exclusively. As a typical representative of plant-cryptochromes, this work focuses on Arabidopsis thaliana Cryptochrome-1 (AtCry-1). The survey is thereby dealing with the following two aspects, to approach the questions associated with AtCry-1's light-correlated mechanism from different points of view. Firstly, the kinetics of photo-activation and dark adaption of AtCry-1 was measured in intact host cells. Also, an influence of green and blue light on the flavin radical state could be observed. This results yield important physiological information that can not be extractet out of experiments on protein alone. Finally, a comparison of ENDOR-measurements done on both, purified protein and overexpressing cells, suggests the existence of small structural differences in the conformation of the flavin cofactor. Secondly, measurements on the electron-transfer process after flavin-activation could be performed. Those experiments show remarkable differences to published results on photolyases and cry-DASH-proteins. Since all these proteins share a very high structural similarity, this illustrates the possibly strong influence on physiological properties due to slight variations iin sequence.