Glykanbindungsspezifität von Lektinen kariesätiologisch bedeutsamer Bakterien

Abstract

Zu den weltweit am häufigsten und am weitesten verbreiteten bakterienbedingten Erkrankungen des Menschen zählt trotz beachtlicher Präventionserfolge noch immer die Karies, deren Behandlung hohe Kosten im Gesundheitswesen verursacht. Derzeit ist auf dem Gebiet der Kariesprophylaxe eine eingetretene Stagnation zu beobachten. Innovative kariespräventive Maßnahmen zusätzlich zu den sich bereits in Anwendung befindlichen etablierten Strategien erscheinen daher notwendig, um die Ausbreitung dieser Volkskrankheit weiterhin zu minimieren. Da die Adhäsion und Etablierung pathogener Mikroorganismen auf der Zahnoberfläche den initialen Schritt im Infektionsgeschehen darstellt, gewinnt die antiadhäsive Therapie durch eine mögliche Verhinderung dessen an zunehmender Bedeutung. Bisher beschäftigen sich jedoch nur wenige wissenschaftliche Studien mit der Charakterisierung der Bindungsspezifität kariesätiologisch bedeutsamer Bakterien. Aufgrund der besonderen Bedeutung der Mutans-Streptokokken im Kariesgeschehen war es das Ziel dieser Studie, die adhäsionsvermittelnden Oberflächenmembranproteine (Lektine) zweier Streptococcus mutans-Subtypen und Streptococcus sobrinus bezüglich ihrer Bindungsspezifität zu untersuchen. Die bakteriellen Lektine der kultivierten Bakterienspezies wurden dazu in Form eines bakteriellen Homogenats weitestgehend isoliert und biotinyliert. Mit Hilfe des kompetitiven Lektinbindungs-Inhibitionsassays konnten die bakteriellen Homogenate bezüglich ihres Bindungsverhaltens gegenüber PNA-, SNA-, GNA-, ConA- und AAA- spezifischen Glykanstrukturen sowie einer möglichen konzentrationsabhängigen Verdrängung durch entsprechende Glykokonjugate charakterisiert werden. Das Blotten der zuvor gelelektrophoretisch aufgetrennten Proteine der bakteriellen Homogenate auf glykanspezifisch vorbehandelte PVDF-Membranen ermöglichte die qualitative Proteinanalyse all der für die spezifische Glykanbindung verantwortlichen Proteine. Durch den gleichzeitigen Einsatz deglykosylierter Glykanstrukturen war der Ausschluss all der Bindungsmechanismen, die dabei nicht auf einer Protein-Kohlenhydrat-Bindung (Lektinbindung) basierten, möglich. Die vermutete Bindungsheterogenität innerhalb der Mutans- Streptokokken ließ sich sowohl interspezifisch zwischen den Subspezies S. mutans und S. sobrinus als auch intraspezifisch innerhalb einer Subspezies am Beispiel von S. sobrinus bestätigen. Es ist daher anzunehmen, dass die Mutans- Streptokokken über Lektine mit unterschiedlicher Bindungsspezifität in der Lage sind an die Wirtsoberfläche zu adhärieren. Die aus früheren Speicheluntersuchungen bekannte terminale Galaktosyl-Spezifität von S. mutans konnte im Rahmen dieser Studie bestätigt werden. Für S. sobrinus hingegen erfolgte der in der Literatur bisher unbekannte Nachweis einer ausgeprägten Bindungsspezifität gegenüber einer terminalen Mannose-Struktur, in Form einer Oligomannose. Darüber hinaus ließ sich das bakterielle Homogenat von S. sobrinus durch terminale Sialinsäure inhibieren, allerdings in vergleichsweise deutlich schwächerem Ausmaß. Der Besitz einer terminalen Fukose-Spezifität konnte für alle drei bakteriellen Homogenate ausgeschlossen werden. Für jede der eingesetzten Bakterienspezies ließ sich jeweils mehr als ein Lektin unterschiedlichen Molekulargewichts für die spezifische Lektinbindung auf der bakteriellen Oberfläche identifizieren. Die ermittelten Molekulargewichte der entsprechenden Lektine liegen dabei für S. mutans bei 90 kDa und 155 kDa, für S. sobrinus bei 35 kDa und 45 kDa. Aufbauend auf dem im Rahmen dieser Studie entwickelten in-vitro-Versuchsablaufs ist eine zukünftige routinemäßige Bestimmung der individuellen Bindungsspezifität vorherrschender kariesinduzierender Bakterien durchaus vorstellbar. Im Rahmen der Kariesprophylaxe kann so durch kompetitive Hemmung nach Zufuhr eines individuellen heterogenen „Glykan-Cocktails“ die Etablierung kariesätiologisch bedeutsamer Bakterien auf der Zahnoberfläche gezielt unterbunden werden, ohne dabei die residente, apathogene Standortflora zu beeinflussen. Das Verhindern der zuckerabhängigen Volkskrankheit Karies mit Hilfe einer spezifischen „Zuckerlösung“ stellt demnach einen durchaus interessanten Aspekt in der zukünftigen Kariesprävention und/oder -therapie dar.

Caries remains one of the most common and widespread bacterial-induced diseases amongst humans. Although remarkable efforts are made it is still causing enormous costs in health systems. Due to the current stagnation within caries prevention continuing development of innovative preventive strategies and techniques seem to be indispensable to minimize further expansion of this disease. Since the adhesion of bacteria to the tooth surface represents the precondition of dental plaque formation and subsequent caries development the anti-adhesive therapy gains significant importance by a possible prevention. So far there are only few scientific studies concentrating on the characterization of the binding specificities of caries-inducing microorganisms available. Within caries etiology the mutans streptococci are of distinctive importance. Thus, the aim of this study was to evaluate potential differences in glycan-binding specificities of two Streptococcus mutans-subspecies and Streptococcus sobrinus. Therefore the bacterial lectins of the primarily cultivated microbial strains were isolated and biotinylated in form of a purified fraction. A competitive enzyme-linked lectin-binding assay was used to identify the binding of the glycan-portion of the bacterial surface lectins towards PNA-, SNA-, GNA-, ConA- and AAA-specific glycan patterns as well as a potential inhibition by solubilized complementary glycans in dependence on their concentration. Blotting of the electrophoresis pretreated microbial proteins on glycan-specific PVDF-membranes enabled a qualitative protein-analysis of all bacterial lectins which are responsible for the specific glycan-binding. The exclusion of all non-protein- carbohydrate-based binding-mechanisms (non-lectin-bindings) was obtained by applying deglycosylated glycan patterns in the same experimental setup. The expected heterogeneity within the mutans streptococci could be verified interspecifically between the S. mutans-subspecies and S. sobrinus as well as intraspecifically within one of the subspecies (S. sobrinus). These findings suggest that the mutans streptococci possess surface lectins with heterogeneous glycan-binding sites in order to adhere to oral surfaces. Earlier reported glycan-binding specificity for terminal galactose-residues could be confirmed in this study. Contrarily, the finding of a significant mannose-binding-specificity in form of an oligomannose of the S. sobrinus- subspecies is yet unknown. Additionally, terminal sialyl-residues were shown to inhibit S. sobrinus as well, but clearly in a comparable lesser degree. The possession of terminal fucose-specificity could be excluded for all of the tested mutans streptococci. In conclusion, each of the tested strains showed more than one surface lectin responsible for the specific lectin-binding with varied molecular weight (S. mutans 90 kDa/155 kDa, S. sobrinus 35 kDa/45 kDa). Regarding the established experimental concept and technique this present in vitro study might be used as a future standard procedure for the identification of the individual binding-specificity of predominant caries- inducing microorganisms. In the field of caries prevention it supplies the ability to prevent the lectin-mediated adhesion of mutans streptococci to oral surfaces. This could be achieved through the competitive inhibition by a heterogenous individual “glycan-cocktail” without disturbing the resident non- pathogen oral flora. Preventing a sugar-depending disease with the help of a specific “sugar solution“ provides a new perspective of future caries- preventive and/or therapeutical strategies.